早春栽培的印度南瓜果实淀粉积累相关酶的活力

摘 要：为选育果实淀粉含量高、适于早春日光温室栽培的印度南瓜，以Agol、雪2父、S8844、无名绿4份高代自交系种质为试材，研究果实发育期间（授粉后14、21、28、35、42 d）淀粉含量动态变化及其与AGPase、GBSS、SSS、SBE、α-淀粉酶、β-淀粉酶等酶活力的相关性。结果表明，果实发育42 d后，高淀粉含量种质S8844和无名绿的干物质含量（w，后同）分别为26.1%、33.0%，淀粉含量分别为85.2%（干质量）、87.1%（干质量）。与淀粉积累有关的AGPase、GBSS、SBE等酶活力均高于低淀粉含量的2个种质（Agol、雪2父）。在进行适于早春日光温室栽培的印度南瓜品种选育时，可选择果实发育前期的APGase和SBE酶活力作为高淀粉含量种质的筛选指标之一，为高品质印度南瓜种质早期筛选鉴定提供一定的参考依据。

关键词：印度南瓜；果实淀粉含量；淀粉合成酶；淀粉分解酶

中图分类号：S642.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2022）01-024-08

Dynamic changes of fruit starch accumulation-related enzyme activities in early spring cultivated Cucurbita maxima

MA Wei1， ZHANG Meng1， SHI Yuzi1， SHU Qin1， SUN Tingzhen1， BO Kailiang1， WANG Fuli2， DUAN Ying1， WANG Changlin1

（1. Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops of Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China; 2. Beijing Agricultural Technology Extension Station， Beijing 100029， China）

Abstract：In order to breed Cucurbita maxima with high starch content and suitable for greenhouse cultivation in early spring， the dynamic changes of starch accumulation and correlation relationship with the activities of AGPase， GBSS， SSS， SBE， α-amylase， β-amylase were studied in the four inbred lines Agol， Xue2 male， S8844 and Wuminglü. The results showed that after 42 d of fruit development， the dry matter contents of S8844 and Wuminglü were 26.1% and 33.0%， and the starch contents were 85.2% （Dry weight）and 87.1%（Dry weight）， respectively. The enzyme activities of AGPase， GBSS and SBE were higher than those of the other two germplasms. The enzyme activities of SBE and AGPase in the early stage of fruit development could be selected as one of the biochemical indexes. The study could provide a theoretical basis for Cucurbita maxima breeding in early spring greenhouse.

Key words：Cucurbita maxima; Starch content; Starch synthase; Amylase

印度南瓜（Cucurbita maxima）原产于南美洲，是葫芦科南瓜属主要栽培种之一，在我国广泛栽培。印度南瓜果肉是主要食用部位，其肉质软糯，口感甜面，富含碳水化合物、类胡萝卜素、维生素、南瓜多糖等多种营养和保健功能成分，其产业前景日益受到关注[1-3]。

淀粉是1，4-糖苷键组成的葡聚糖，主要分为直链淀粉与支链淀粉两种。淀粉合成在叶绿体或淀粉体中进行，由一系列酶催化完成，主要涉及五类关键酶，分别为ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophsphorylase，APGase）、颗粒型淀粉合成酶（granule-bound srarch synthase，GBSS）、可溶性淀粉合成酶（soluble starch synthase，SSS）、淀粉分支酶（starch branching enzymes，SBE）及淀粉去分支酶（debranching enzymes，DBE）[4-7]。目前利用基因组或转录组测序，已经分别从美洲南瓜（Cucurbita pepo）和中国南瓜（Cucurbita moschata）鉴定到40多个与淀粉代谢调控相关编码基因[6-8]。在印度南瓜中的研究表明，淀粉代谢调控相关编码基因的转录模式在高淀粉种质和低淀粉种质中类似，但GPT、AATP、PGM、AGPaseL、GBSS I、SSS III和SBE I等基因表达水平差异显著，推测南瓜果实淀粉积累与淀粉合成前体限速酶APGase、颗粒型淀粉合成酶关键酶GBSS、可溶性淀粉合成关键酶SSS以及淀粉分支酶SBE密切相关，而淀粉去分支酶DBE的主要作用是将不正确的α-1，6-糖苷键分支进行水解，其是否参与淀粉降解还有待进一步研究[9]。利用转录组测序对不同淀粉含量的中国南瓜果实淀粉代谢调控相关基因进行分析，发现GBSS、SSS和SBE是不同南瓜果实淀粉积累差异的关键基因[10]。

印度南瓜果肉淀粉组分和含量是重要果实品质性状之一，淀粉含量与果实口感品质密切相关[11-12]。对印度南瓜研究的结果表明，低淀粉含量品种的果肉质地疏松粗糙，口感生涩，而高淀粉含量品种的果肉质地致密细腻、甜面，其直链淀粉和支链淀粉含量均显著高于低淀粉含量种质[13]。然而目前在印度南瓜品种选育的实际应用中，通常以口感作为果实品质性状鉴定的手段，容易受到评价者的经验、果实成熟状态等影响，一定程度上影响了鉴定准确性[12]。

不同栽培方式对南瓜果实淀粉含量存在较为明显的影响[14-16]。目前，对中国南瓜的研究表明，与露地栽培相比，日光温室栽培模式下的中国南瓜在果实品质和产量等方面均有较大提高，并且采收期明显提前[16]。在我国北方地区，露地栽培方式生产的南瓜，在生长前期容易受到低温冷害，生长后期容易因高温感染病毒病导致果实畸形，往往对产量造成严重影响。随着人们对印度南瓜消费需求的提升，筛选适宜保护地早春茬口栽培的优质品种越来越受到重视。研究早春日光温室栽培条件下果实淀粉合成及相关酶代谢规律，明确影响果实淀粉积累的关键生理指标，对于筛选创制南瓜优异种质具有重要意义。笔者在本试验中在早春茬日光温室栽培条件下，利用Agol、雪2父2份低淀粉含量种质和S8844、无名绿2份高淀粉含量种质，研究淀粉代谢相关酶活力对果实淀粉积累的影响，以期为筛选鉴定适宜早春茬口保护地栽培印度南瓜的优异种质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验选用4份印度南瓜自交系Agol、雪2父、S8844、无名绿，均为中国农业科学院蔬菜花卉研究所南瓜课题组培育8代以上的高代自交系。其中，雪2父、S8844、无名绿为蔓生种质，单株结瓜数2～4个，Agol为短蔓种质，单株结瓜数4～6个。S8844、无名绿果实口感甜面，果肉淀粉含量和可溶性固形物含量高。Agol、雪2父果实口感较苦，果肉淀粉和可溶性固形物含量较低。

1.2 试验设计

试验于2018年3—7月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所河北廊坊试验基地进行。2018年3月15日选取籽粒光滑饱满的南瓜种子，28 ℃生长箱内催芽2 d后，播种至32孔穴盘育苗，当幼苗长至2叶1心时，定植于日光温室内，温室长100 m，高3.5 m，畦长6.5 m，行距1.3 m，株距0.5 m。光量子通量密度（PFD）为410 μmol·m-2·s-1，最高气温33.5 ℃，最低气温8.2 ℃，昼夜平均气温21.1 ℃，最高湿度89.5%，最低湿度19.4%，昼夜平均湿度为51.77%。5月1日进行人工授粉，雌花经人工授粉后于14、21、28、35、42 d对生长一致的果实进行采收，并对相关指标进行测定。按照采收日期，分别将3枚果实的去籽果肉切块冻于液氮中，待全部果实采收完毕，进行淀粉代谢相关酶活力检测。

1.3 果实质量和干物质含量测定

南瓜鲜果实质量采用电子天平进行测定。果肉去除果皮和籽粒后，称取100 g鲜果肉（m1），切成薄片，在65 ℃恒温干燥箱内烘干48 h，取出后进行称质量（m2），果肉干物质含量测定公式为（m2/m1）×100%。

1.4 淀粉含量测定

称取约10.0 g南瓜烘干果肉，采用研磨仪进行充分研磨，设定参数为60 Hz，60 s/次，共进行3次研磨，获得果肉烘干粉末。南瓜果肉淀粉提取方法参照Stevenson等[17]方法进行提取，称取2 g 果肉烘干粉末，加入0.05% NaOH溶液充分震荡24 h，12 000 r·min-1离心10 min后加入蒸馏水进行清洗2次，沉淀转移至50 mL离心管，5000 r·min-1离心10 min后弃上清，沉淀加入9 mL 0.1 mol·L-1 NaCl和100 μL 10%甲苯进行脱脂清洗，加入蒸馏水进行2次清洗，再加入无水乙醇进行2次清洗后，转移至Whatman No 4滤纸上，35 ℃烘干，获得淀粉粗提样品。

南瓜果肉直链淀粉和直链淀粉测定方法参照范明顺等[18]方法进行并略作修改。称取25 mg淀粉粗提样品置于25 mL容量瓶中，加入250 μL 95%乙醇，1 mol·L-1 NaOH 2.25 mL，30 ℃恒温箱内糊化24 h，加热至95 ℃振荡保温8 min。待淀粉完全溶解后，冷却至室温，定容至25 mL。将一定浓度的稀释液转移至新的容量瓶中，加入1 mol·L-1乙酸250 μL，500 μL碘比色液，定容至2 mL。采用分光光度法分别于620 nm波长下测定直链淀粉含量，于535 nm和730 nm波长下测定支链淀粉含量。以马铃薯直链淀粉和支链淀粉配制成1.0 mg·mL-1溶液，按照如下体积比例混合配制标准溶液：直链淀粉0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 μL；支链淀粉4.75、4.5、4.0、3.5、3.0 μL。将标准溶液加入碘比色液，并稀释至25 mL，在620 nm、535 nm、730 nm波长下测定吸光值。直链淀粉和直链淀粉的含量以相关标准曲线进行计算。直链淀粉标准曲线为：y=1.482 4x+0.007 7（R2=0.995 4），支链淀粉标准曲线为：y=-0.232 5x+0.217 6 （R2=0.996 5）。

1.5 淀粉相关酶活测定

参照Nakamura（1989）方法进行并略作修改[19]。

1.6 数据统计分析方法

采用Microsoft Excel 2010进行数据统计，SPSS 23.0对数据进行单因素方差分析，并运用Duncan’s检验法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 印度南瓜果实不同发育时期生长指标

对Agol、雪2父、S8844和无名绿不同发育时期的单瓜鲜质量和干物质含量进行测定（表1）。雪2父单瓜鲜质量在授粉后14 d增长幅度最大，是其他种质的1.6～1.8倍。在果实生长中期（28～35 d），Agol和S8844、无名绿单瓜鲜质量较发育初期均有较大幅度增长，至果实成熟期（42 d）Agol和S8844的单瓜鲜质量均接近雪2父，约为1.30 kg和1.48 kg。无名绿单瓜鲜质量在4份种质中最低，至果实成熟期仅为1.13 kg，约为其他种质的66%～87%。