不同类型甜瓜高效再生体系的建立

摘    要：以厚皮甜瓜（Cucumis melo ssp. melo var. cantalupensis，C. melo ssp. melo var. ameri）、厚薄皮甜瓜（C. melo ssp. melo var. inodorus）和薄皮甜瓜（C. melo ssp. agrestis var. chinensis，C. melo ssp. agrestis var. makuwa Makino）以及对照组（BU-21/3，C. melo ssp. melo var. inodorus和Védrantais，C. melo ssp. melo var. cantalupensis）共8个甜瓜自交系的子叶为外植体，比较不同激素配比、不同苗龄对甜瓜再生过程中不定芽诱导及生根的影响。结果表明，甜瓜不定芽诱导的最佳培养基配方为MS+1.0 mg·L-1 6-BA，不同类型甜瓜的不定芽诱导率可达72.0%～90.3%，且薄皮甜瓜不定芽诱导率高于厚皮甜瓜和厚薄皮类型甜瓜；3 d苗龄的子叶外植体不定芽诱导率最高。伸长培养基配方为MS+0.1 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 IAA，生根培养基配方为MS+0.1 mg·L-1 IBA+3 g·L-1活性炭。

关键词：甜瓜；再生体系；诱导率；植物激素

中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2022）01-032-05

Establishment of regeneration system for different varieties of melons

ZHANG Chunqiu1， LI Sibei1， HU Ziyu1， LÜ Guiyun2， WANG Jianshe1

（1. Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops （North China）/Beijing Key Laboratory of Vegetable Germplasm Improvement/Beijing Vegetable Research Center， Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science， Beijing 100097， China; 2. Hebei Agriculture University， Department of Horticulture， Baoding 071001， Hebei， China）

Abstract： The cotyledon explants from eight inbred lines of melon were used to compare the influential effects of their different phytohormones at different ages to the adventitious shoot/root inductions in the regeneration process of melon. Two from each of the three followings types： the thick-skin type （C. melo ssp. melo var. cantalupensis and C. melo ssp. melo var. ameri）， the intermediate-skin type （C. melo ssp. melo var. inodorus）， thin-skin type （C. melo ssp. agrestis var. chinensis and C. melo ssp. agrestis var. makuwa Makino） and the controls （BU-21/3， C. melo ssp. melo var. inodorus and Védrantais， C. melo ssp. melo var. cantalupensis）.The results showed that the optimal medium for the adventitious shoot induction was MS+1.0 mg·L-1 6-BA， giving an induction rate of 72.0%-90.3% in different types of melon. The adventitious shoots induction rate in thin-skinned type was higher than that in the other two types. The optimal age of cotyledon explant was 3 d. The optimal conditions for shoot induction and root induction were MS+0.1 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 IAA， and MS+0.1 mg·L-1 IBA+3 g·L-1 activated carbon， respectively.

Key words： Melon; Regeneration; Induction rate; Phytohormone

甜瓜（Cucumis melo L.）属于葫芦科甜瓜属，是一种国内外普遍栽培的水果型作物。2020年全球甜瓜产量已达2.7×107 t，种植面积达1.1×106 hm2（FAO，www.fao.org/faostat）。随着甜瓜的规模化生产，病虫害的问题也随之日益严重，造成甜瓜产量锐减、品质下降。近年来，基因工程技术快速发展，使得运用转基因技术手段进行种质定向改良成为培育抗病优质甜瓜新品种的有效途径。建立一个稳定、高效的再生体系，是基因工程育种成功的前提条件。

影响甜瓜再生能力的主要因素有基因型、外植体类型及其生长状态、激素种类和浓度配比。基因型对甜瓜再生能力起决定性的作用，不同类型甜瓜的再生潜力有明显差异，已有研究分别针对厚皮和薄皮等不同类型甜瓜建立了特定的再生体系[1-9]。但甜瓜离体再生过程中仍存在愈伤组织分化出芽困难、不定芽诱导率较低和再生体系重复性差等问题[10]。因此，对不同类型甜瓜再生体系进行系统优化以建立广泛适用的再生体系显得尤为迫切。外植体的类型及生长状态是建立甜瓜再生体系的影响因素之一。目前，已有选用子叶、下胚轴、真叶、叶片等通过器官发生途径再生出完整植株的报道[6，11]。其中，子叶相比其他器官出愈较快且愈伤组织紧密，不定芽诱导率也相对较高，被认为是甜瓜再生的首选外植体[12]。甜瓜子叶的再生能力与苗龄密切相关，不同苗龄甜瓜子叶的不定芽诱导率存在较大差异[2，7-8，13]，合适的苗龄是成功诱导不定芽的关键因素。影响甜瓜再生的另一个重要因素是生长调节剂的种类和浓度配比。目前，常用于甜瓜再生的激素有6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等[11，14-15]，选择合适的激素种类和浓度配比是建立高效稳定的甜瓜再生体系的研究重点。

笔者在本试验中以不同类型（厚皮、厚薄皮中间型和薄皮）的8个甜瓜自交系材料子叶作为外植体，对基因型、外植体苗龄、不同激素组合和浓度配比等影响甜瓜再生效率的主要因素进行系统深入研究，以构建适于不同类型甜瓜的高效再生体系，为甜瓜快速繁殖、应用遗传转化技术对甜瓜种质资源进行定向改良等提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

笔者分别以厚皮类型甜瓜M1（C. melo ssp. melo var. cantalupensis）和M2（C. melo ssp. melo var. ameri）；厚薄皮类型甜瓜M32和M36（C. melo ssp. melo var. inodorus）；薄皮类型甜瓜M250（C. melo ssp. agrestis var. chinensis）和M265（C. melo ssp. agrestis var. makuwa Makino）；对照组薄皮甜瓜BU-21/3（C. melo ssp. melo var. inodorus）和厚皮甜瓜Védrantais（C. melo ssp. melo var. cantalupensis）等不同类型8个甜瓜自交系作为供试材料。其中，M1、M2、M32、M36、M250和M265为北京市农市农林科学院蔬菜中心选育，BU-21/3和Védrantais种子分别由以色列农业科学院 Yaakov Tadmor 研究员和美国农业部J. D. McCreight研究员馈赠，在北京市农林科学院蔬菜研究中心温室扩繁。其中，Bu-21/3为具有高再生能力的甜瓜材料，Védrantais为研究甜瓜再生体系常用的材料。试验于2016年3月至2019年10月在北京市农林科学院蔬菜研究中心进行。以MS为基本培养基，根据不同生长阶段配制添加不同激素浓度配比。其中，激素种类包括IAA、IBA和6-BA。以上试剂均购于美国Sigma试剂公司。

1.2 方法

1.2.1    种子处理    挑取饱满的甜瓜种子，剥去种皮后用70%（φ，后同）的乙醇浸泡20～30 s，无菌水洗2～3次，用1%的次氯酸钠溶液消毒10 min，无菌水洗涤4～5次后，用无菌滤纸吸干多余水分，置于MS培养基（蔗糖质量浓度30 g·L-1，琼脂质量浓度7 g·L-1，pH 5.8）中暗培养。

1.2.2    不定芽的诱导    取苗龄为3 d的甜瓜子叶，切除胚根和子叶两端1～2 mm后，剥除子叶的内种皮，将子叶部分横切为二作为外植体，叶背面向下接种于附加不同激素配比的诱导培养基（见表1），置于25 ℃，光照度为2000 lx，光周期为16 h/8 h培养。30 d后调查统计发生不定芽的外植体数，以筛选出不定芽诱导最佳激素配比组合，并比较基因型不定芽诱导率的差异。分别取2、3、4、5 d苗龄的甜瓜子叶，置于MS+1.0 mg·L-1 6-BA不定芽诱导培养基中，30 d后观察不同苗龄外植体不定芽的诱导情况。每个处理30个外植体，3次重复。不定芽诱导率/%=产生不定芽的外植体数/接种外植体总数×100。采用SPSS 17.0软件中的Duncan’s multiple range test方法进行差异显著性分析。

1.2.3    不定芽的伸长与生根    选取厚皮类型M2、厚薄皮类型M32和薄皮类型M265三个甜瓜品种进行不定芽伸长和生根试验。不定芽诱导培养3～4周，待丛生芽长至0.5～1.0 cm，及时切下分化的不定芽转入芽伸长培养基（表2），比较不同激素配比对不定芽伸长的影响。当不定芽伸长到2～3 cm时，切下不定芽，转入生根培养（表3），比较不同激素对不定芽生根的影响。待确定最佳浓度配比后，将生根培养基添加3.0 mg·L-1的活性炭防止形成玻璃苗。生根率/%=生根的不定芽数/接种的总不定芽数×100。

1.2.4    试管苗的移栽    待试管苗根系发达后，炼苗3～5 d后，洗净根上附着的培养基，移栽入预先经高压灭菌的蛭石和草炭土1∶1（V∶V）基质中于温室中培养，前期注意保湿遮阴，3～5 d后逐渐增加透光量。

2 结果与分析

2.1 不同类型甜瓜材料和激素配比对甜瓜不定芽诱导的影响

由表1可以看出，不同类型甜瓜在含相同激素浓度配比的培养基中不定芽诱导率表现有所不同，薄皮型甜瓜M250和M265不定芽诱导率高于厚皮和厚薄皮类型。此外，不定芽的诱导和分化与6-BA和IAA的质量浓度配比密切相关。随着6-BA和IAA质量浓度的增加，不定芽的诱导率随之降低，8个不同甜瓜材料在MS8（MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.6 mg·L-1IAA）不定芽诱导率最低。分析发现在含1.0 mg·L-1 6-BA的培养基中添加低质量浓度的IAA（0.2 mg·L-1）对不定芽的诱导影响较小，8个不同类型甜瓜材料在MS1（MS+1.0 mg·L-1 6-BA）和MS2（MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1 IAA）上的不定芽诱导率均没有显著性差异。不同基因型甜瓜材料的不定芽诱导最佳培养基有所不同，对照组（BU-21/3和Védrantais），厚皮型（M1和M2），厚薄皮类型（M32和M36）和薄皮型M265在MS1培养基中不定芽诱导率最高，分别为90.3%、87.3%、72.0%、83.0%、73.6%、75.6%和89.3%。其中，对照组BU-21/3不定芽诱导率最高，薄皮型M265表现出与对照组相近的较强再生能力。薄皮型甜瓜M250在MS2培养基上诱导率最高（85.3%），但其在MS1培养基上同样具有较高的诱导率（84.7%）。综合考虑，不同甜瓜材料后续试验采用的不定芽诱导培养基配方为MS+1.0 mg·L-1 6-BA。