1株优良生防细菌的筛选及其对甘肃温室黄瓜枯萎病的防治效果

摘    要：为了有效防控甘肃温室黄瓜枯萎病，获得生防效果较好的高效拮抗菌株，从甘肃武威市凉州区日光温室大棚黄瓜枯萎病根际土分离多株菌株，通过平板拮抗试验、室内盆栽效果试验，得到1株对尖孢镰刀菌（Fuasrium oxypsorum）有较强抑制作用的假单胞属菌株33-1，经鉴定33-1为弗雷德里克斯堡假单胞菌（Pseudomonas frederiksbergensisi）。结果表明，33-1具有很好的苗期防治效果，可达86.95%，对植株生长有促进作用。认为33-1有开发为防治温室黄瓜枯萎病生防制剂的潜力。

关键词：温室黄瓜；枯萎病；生防细菌；生防假单胞菌

中图分类号：S642.2 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2022）01-086-05

Screening and identification of an excellent biocontrol bacteria against cucumber Fusarium wilt in heliogreenhouse of Gansu and its biological effect

LI Na， LI Jing， FU Linyun， LIU Jinxia， DING Pin， WU Jianrong

（Institute of Biology，Gansu Academy of Sciences， Lanzhou 730000， GanSu， China）

Abstract： In order to effectively prevent and control cucumber Fusarium wilt in greenhouses and to obtain highly effective antagonistic strains with good biological control effect in Gansu province， several strains of Fusarium wilt were isolated from inter-rhizosphere soil in sunny greenhouses in Liangzhou district， Wuwei City， Gansu Province. We obtained a strain 33-1 Pseudomonas with strong inhibitory effect on Fuasrium oxypsorum through plate antagonism test and indoor potting effect test. 33-1 was identified as Pseudomonas frederiksbergensisi. The results showed that 33-1 had a good seedling control effect， up to 86.95%， and it can promote plant growth. It is considered that 33-1 has the potential to be developed as a bio-control agent against Fusarium wilt in greenhouse.

Key words： Greenhouse cucumber; Fusarium wilt; Bio-control bacteria; Biocontrol Pseudomonas aeruginosa

黄瓜枯萎病由尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）这一类真菌侵染，从苗期到结果期均会发病，开花结果期发病最为严重。发病初期，黄瓜植株上的叶片在中午高温时出现萎蔫症状，早晚气温转凉时，萎蔫症状又恢复正常。发病的中后期，植株上萎蔫的枝叶会逐渐增加，气温转凉时症状也难以恢复，叶片出现由下向上逐步变得枯黄萎蔫，直至茎秆成水浸状腐烂。黄瓜枯萎病主要经土壤传播的维管束病害，露地和保护地栽培黄瓜上均可发生，连作地区尤为严重，现已成为世界范围内影响黄瓜生产的毁灭性土传病害。发病率在20%～30%，造成黄瓜产量下降，严重时在80%～90%，可导致黄瓜严重减产[1-2]。目前，此病害己成为生产上制约黄瓜产量和品质的重要因素之一，而黄瓜是日光温室反季节栽培的主要蔬菜种类，栽培面积已占日光温室生产面积的50%以上[3]。所以，此病害也成为制约现代农业发展的重要因素。

目前，农业生产主要就是采取田间轮作和植株嫁接的方法，还会使用和化学农药相结合的方法来防治黄瓜枯萎病。但这些方法效果往往不稳定，化学农药虽然可以有效控制温室黄瓜枯萎病的发生，但长期使用化学农药所产生的农药残留不仅污染土壤和地下水，也危害人畜健康，而且随着内吸性杀菌剂大量使用，病菌易产生抗药性，防效会逐渐降低[4-5]。

如今，用生物防治的方法控制温室黄瓜枯萎病越来越得到人们的关注和青睐。人们已经从土壤中筛选出多种有益微生物。其中，植物根际促生菌作为具有防病潜力和应用价值的一类生防菌受到国内外学者关注[6-7]，并用于土传病害的防治。目前，已报道对黄瓜枯萎病有生防潜力的拮抗菌包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、木霉属真菌、链霉菌等[8]，但有关弗雷德里克斯堡假单胞菌对黄瓜枯萎病菌的防控作用目前还未见报道。笔者从已分离鉴定的黄瓜根际微生物中检测对尖孢镰刀菌黄瓜专化型具有较好拮抗作用的菌株，开展抗病试验，为温室黄瓜枯萎病防治的生物农药开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

生防菌株：菌株F-2、33-1、F-4、N-2、N-Z、N-6、N-8、N-9，均为该实验室分离，2018年筛选于甘肃省武威市凉州区日光温室黄瓜根际土壤。

供试病原菌：尖孢镰刀菌黄瓜专化型 （Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）购于中国微生物菌种保藏中心。供试黄瓜：津育二号黄瓜。

供试药剂：50%多菌灵可湿性粉剂。

培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基。

仪器：苏净安泰超净工作台SW-CJ-2 FD、上海申安立式高压蒸汽灭菌锅LDZF-50 L、上海森信霉菌培养箱。

1.2 方法

试验于2018年10月在甘肃省科学院生物研究所实验室开展。

1.2.1 拮抗菌株对尖孢镰刀菌的抑制作用 采用牛津杯法[9]将实验室前期筛选出对尖孢镰刀菌有一定抑制作用的菌株F-2、33-1、F-4、N-2、N-Z、N-6、N-8、N-9接种在牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，28 ℃恒温活化48 h，活化后将8种供试拮抗菌接在牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28 ℃恒温培养24 h。将尖孢镰刀菌接在PDA平板培养基中26 ℃恒温活化96 h后，将尖孢镰刀菌孢子液均匀涂布在9 cm的培养皿中，在培养皿中心放置内径为6 mm的牛津杯，每个牛津杯中分别加入8种供试拮抗菌，在26 ℃恒温培养箱中培养，设空白对照（无菌水处理），每株供试菌设3次重复，待对照平板菌落长满时测量抑菌圈大小，比较空白对照及各供试菌株病原菌菌落直径，筛选对尖孢镰刀菌拮抗性能良好的生防菌株[9]。

1.2.2    拮抗菌发酵液对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制作用    采用菌丝生长速率法[10]，测定菌株发酵产物的抑菌活性即发酵液对病原菌菌丝生长抑制作用。将拮抗细菌接入到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28 ℃恒温培养48 h，制成发酵液。将尖孢镰刀菌接在PDA平板培养基中26 ℃恒温活化96 h。用200 μL拮抗菌株F-2、33-1、F-4、N-2、N-Z、N-6、N-8、N-9液体发酵液均匀涂在PDA平板上，在平板中心放置5 mm病原菌菌饼，以无菌水为对照，26 ℃下培养7 d，每处理设3次重复，用十字交叉法测量病原真菌菌落直径，计算菌丝生长抑制率。

菌丝生长抑制率=（对照菌落生长直径-处理菌落生长直径）/对照菌落生长直径×100%。

1.2.3    优良拮抗菌株鉴定    拮抗菌的鉴定用常规方法结合分子鉴定方法完成。

将拮抗效果最好的菌株33-1进行革兰氏染色、菌体形态、菌落形状观察；菌株生理生化反应参照《常见细菌系统鉴定手册》中的方法[11]。16 S rDNA测定是由上海基康生物技术有限公司完成并通过MEGA 7软件构建系统进化树。

1.2.4    优良菌株33-1对黄瓜枯萎病的防治及其促生效果    采用蘸根接种法测定优良菌株33-1对黄瓜枯萎病的防治及其促生效果[12]。将拮抗菌33-1接入牛肉膏蛋白胨液体培养基28 ℃培养2 d备用，将病原菌尖孢镰刀菌接种在PDA液体培养基中26 ℃培养7 d，制成尖孢镰刀菌菌悬液备用。将购买的津育二号黄瓜种子在45 ℃水中泡种1 h，之后经过70%酒精消毒1 min，HgCl2消毒1 min，无菌水冲洗多次后放入培养皿中25 ℃催芽3 d，之后将芽根部划伤，将划伤的芽根部在之前培养好的尖孢镰刀菌菌悬液中浸泡5 s，后接入育苗盘中，并将尖孢镰刀菌菌悬液每穴6 mL灌在距茎部1 cm周围，24 h后灌根接入拮抗菌33-1液体悬浮液6 mL，拮抗菌菌液处理分B（原液）、A（10-1）、C（10-2）、D（10-3）、E（10-4）5个浓度。每个处理30个重复，并设有CK空白对照（不接病原菌）、CK（病原菌+清水）、CK培对照（病原菌+培养基）、CK药剂对照（病原菌+50%多菌灵可湿性粉剂稀释1000倍）。温度24～28 ℃，相对湿度50%～70%。30 d后调查发病情况，统计病情指数[13]、计算防治效果并测量植株株高、根长、总质量。黄瓜枯萎病分级标准见表1

植株发病程度及病情分级标准计算病情指数按公式（1）（2）进行计算。

病情指数/%=∑（病情级值×该病情级株数）/（病情最高级值×总株数）×100；                             （l）

相对防治效果/%=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100   。                                   （2）

1.3 数据分析

试验数据用Excel 2007和SPSS 23.0统计分析软件进行方差分析和显著性水平检验。

2 结果与分析

2.1 高拮抗菌株筛选

牛津杯法筛选结果（表2）显示，33-1对尖孢镰刀菌有较好的抑制作用，病原菌菌落直径最小，F-2、N-Z次之，N-6、F-4对病原菌也有一定的抑制作用，N-8的抑菌效果最差。

菌丝生长速率法对比结果（表3）显示，与对照比，8种拮抗菌发酵液对病原菌菌丝生长均有极显著抑制作用。其中，N-Z、N-6和F-4对病原菌菌丝生长有一定抑制作用，3种拮抗菌没有显著性差异，抑菌效果相当。33-1和F-2和CK相比较有极显著差异，并且33-1对病原菌菌丝生长抑制率可达64.65%，F-2对病原菌菌丝生长抑制率可达55.81%，N-2、N-8和N-9对菌丝生长抑制率较低，均不超过30%，但三者间差异极显著。由图1也可明显看出8种拮抗菌对病原菌菌丝生长抑制的差异。