甲基磺酸乙酯诱变西瓜种子的条件优化

摘    要：为探明EMS诱变西瓜种子的最佳条件，以石红为试材，设置种子切口与不切口2种处理方式，采用6个诱变浓度（0.40%，1.00%，1.20%，1.40%，1.60%和2.00%）和5个诱变时间（4、10、12、14、16 h）共30个不同处理组合对西瓜种子萌发的影响进行研究。结果表明，切口处理能显著提高西瓜种子对EMS诱变剂的敏感性，共筛选出6个处理组合，诱变效果最接近半致死剂量，分别是1.20%+12 h、1.20%+14 h、1.20%+16 h、1.40%+12 h、1.40%+14 h和1.40%+16 h，对应的西瓜种子相对发芽率分别为50.38%、52.21%、51.97%、48.95%、49.97%和48.82%。以用量少且用时短为原则，确定EMS诱变西瓜种子的最佳组合是1.20% EMS诱变12 h。

关键词：西瓜；甲基磺酸乙酯；诱变；条件优化

中图分类号：S651 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2022）01-081-05

Optimization of conditions for mutagenesis of watermelon seeds with ethyl methanesulfonate

ZHAO Zhan1， WANG Xiaoting1， LI Lin1， HOU Shengcan2， HUO Zhibang2， ZHANG Xincheng1

（1. Kaifeng Agricultural Internet of Things Engineering Technology Center/Research Center of High-standard Farmland Intelligent Irrigation Project in Henan/College of Information Engineering， Kaifeng University， Kaifeng 475004， Henan， China; 2. Kaifeng Academy of Agriculture and Forestry， Kaifeng 475004， Henan， China）

Abstract： To investigate the optimal condition of ethyl methanesulfonate（EMS）on the seed germination of watermelon， the variety Shihong was selected as material in this study. Set two treatment methods of seed incision and non incision，. Six different concentrations of EMS（0.40%， 1.00%， 1.20%， 1.40%， 1.60% and 2.00%）and five different induced times（4 h， 10 h， 12 h， 14 h and 16 h） were set up to study the effect on the seed germination of watermelon under 30 different combinations of concentration and time. The results showed that the sensitivity of seeds to EMS mutagens could be significantly improved by incision treatment. A total of six combinations whose mutagenic effect was closest to the standard of half lethal dose were selected. The six combinations were 1.20%+12 h， 1.20%+14 h， 1.20%+16 h， 1.40%+12 h， 1.40%+14 h and 1.40%+16 h， respectively. The corresponding relative germination rates of watermelon seeds were 50.38%， 52.21%， 51.97%， 48.95%， 49.97% and 48.82%， respectively. In summary， the optimal condition was 1.20% of EMS for 12 h according to the principle of using less and using less time.

Key words： Watermelon; Ethyl methanesulfonate; Mutant; Optimization of conditions

西瓜是我国重要的蔬菜型水果，因其品质好、瓤质细、抗病强等特点而深受消费者和生产者的喜爱和信赖，具有很重要的经济价值。但在西瓜长期育种过程中，由于育种目标大多单一，使得西瓜种质资源的遗传基础越来越狭窄，进而使西瓜的产量、品质等重要性状在生产上均受到较大限制；且单一化的种质资源也让西瓜病害越来越严重，常给生产者带来无法挽回的经济损失。鉴于此，在西瓜遗传育种过程中，利用现代育种技术和方法创新种质资源，拓宽其遗传基础就显得尤为重要。

目前，利用物理诱变方法和化学诱变方法对作物进行诱变育种已成为选育新品种、创新种质资源的有效手段[1]。化学诱变方法主要是利用化学诱变剂（如烷化剂、叠氮化物、碱基类似物等）对植物进行诱导变异，具有周期短、频率高、范围广等特点，能够在较短时间内获得大量突变体材料，这些材料直接或间接地应用于新品种和新种质资源的选育[1-2]。甲基磺酸乙酯（EMS，ethyl methanesulfonste）是一种高效稳定且应用广泛的化学诱变剂，在诱变过程中，能够使DNA分子发生较多点突变，染色体畸变减少，并通过置换其他分子中的氢原子使得一些碱基烷基化而诱导突变[3]。大量研究结果表明，要获得良好的诱变效果，必须要有适宜的诱变剂量（诱变剂量=诱变液浓度×处理时间），通常把诱变处理后50.00%植株存活的剂量即半致死剂量作为选择依据[4-5]。弭宝彬等[6]研究发现EMS诱变冬瓜种子时最佳的诱变条件为1.20% EMS诱变12 h，此时冬瓜种子发芽率、成苗率分别为54.67%、51.83%，接近半致死剂量。黄东福等[7]对农作物EMS的诱变条件进行分析后表明大部分作物的EMS诱变半致死剂量在1.00%以内，且处理时间集中在4～8 h时，可以获得较好的诱变效果。

以开封市农林科学研究院的高代自交系石红为研究材料，采用6个处理浓度（0.40%、1.00%、1.20%、1.40%、1.60%和2.00%）和5个处理时间（4、10、12、14、16 h）相互组合的方式，对西瓜种子进行了EMS诱变最佳条件的筛选，通过对诱变处理后种子的发芽率和相对发芽率进行分析，获得EMS诱变西瓜种子的最佳诱变剂量，为构建西瓜突变体库，创制新的种质资源，进而深入研究西瓜的基因组和拓宽西瓜的遗传背景奠定了重要基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试西瓜材料为高代自交系石红，由开封市农林科学研究院西瓜研究所提供。EMS诱变剂（水剂）购自Sigma公司。试验于2020年7月26日至8月初在开封大学信息工程学院农业物联网协同创新中心农业基础实验室进行。

1.2 方法

1.2.1    EMS溶液的配制方法    EMS诱变剂用pH 7.0的0.1 mol·L-1磷酸缓冲液配制成0.40%、1.00%、1.20%、1.40%、1.60%和2.00%的溶液。

1.2.2    EMS的处理方法    西瓜种子诱变前设计2种种子处理方式：指甲刀切口和不切口。将切口和不切口的西瓜种子对EMS的敏感性进行测试：用0.40%和1.00%的EMS溶液分别处理切口和不切口的西瓜种子各4 h和10 h。每个处理用50粒种子，3次重复。

确定最佳的种子处理方式后，将试验设诱变浓度和诱变时间2个因素，采用二因素完全随机区组设计方法，因素1为EMS诱变浓度，设6个浓度水平，即0.40%、1.00%、1.20%、1.40%、1.60%；因素2为诱变时间，设5个诱变时间水平，即4、10、12、14、16 h。试验共30个处理，3次重复，每个处理用50粒种子。试验处理均以pH 7.0的0.1 mol·L-1磷酸缓冲液处理作为对照，诱变结束后，用1.0 mol·L-1的硫代硫酸钠溶液终止反应，接着用0.1 mol·L-1的硫代硫酸钠溶液冲洗，再用蒸馏水清洗3遍，将种子平铺于滤纸上沥水，后用纱布包好放置于28 ℃恒温培养箱中催芽。

1.2.3    测定发芽率    分别统计7 d后的种子发芽数，计算发芽率和相对发芽率，筛选出EMS溶液的半致死剂量，确定最佳的EMS诱变浓度和时间。

发芽率=发芽种子数/供试种子数×100%，相对发芽率=处理的实际发芽率/对应CK的实际发芽率×100%。

1.3 数据处理

采用Excel 2016处理试验数据并分析作图，使用IBM SPSS 22.0统计软件采用LSD法分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 EMS溶液对西瓜种子切口与不切口的影响

利用切口与不切口2种处理方式对EMS诱变西瓜种子的敏感性进行检测后发现（表1），0.40%的低浓度处理下，处理时间为4 h时，与对照相比，切口与不切口2种处理方式对西瓜种子的实际发芽率和相对发芽率无影响，都是100%；但当浓度为0.40%，处理时间为10 h时，切口西瓜种子的实际发芽率和相对发芽率都比对照显著降低了4.00%，而不切口种子的实际发芽率和相对发芽率与对照相比无变化；当诱变浓度为1.00%，处理时间为4 h时，2种处理方式对西瓜种子的实际发芽率和相对发芽率都无显著变化；但当浓度为1.00%，处理时间为10 h时，种子切口的处理方式使西瓜种子的实际发芽率和相对发芽率都分别比对照显著下降了20.00%，而不切口的处理方式下西瓜种子的实际发芽率和相对发芽率仅下降了3.33%。由此可见，当诱变浓度较低且诱变时间较短时，种子不管是切口还是不切口对EMS诱变剂都不敏感；当诱变浓度和诱变时间达到一定程度时，相同条件下，种子进行切口处理能够显著提高西瓜种子对EMS诱变剂的敏感性。

2.2 诱变时间和诱变浓度对西瓜种子发芽率的影响

2.2.1    诱变时间对西瓜种子发芽率的影响    相同诱变浓度条件下，研究诱变时间对西瓜种子发芽率的影响（表2）发现，当诱变浓度为0.40%时，诱变时间分别为4、10、12 h的西瓜种子相对发芽率与对照相比无显著差异，而诱变时间为14 h和16 h时的西瓜种子相对发芽率分别比对照显著降低了7.34%和11.78%；当诱变浓度分别为1.00%、1.20%、1.40%、1.60%和2.00%时，诱变10、12、14、16 h的西瓜种子相对发芽率均低于诱变4 h的相对发芽率，且均达到了显著水平。以上结果表明，诱变浓度和诱变时间对西瓜种子的发芽率都有较大影响，当诱变浓度较低为0.40%时，诱变时间在短期内对西瓜种子发芽率的影响效果差异不明显，但超过一定时间后有显著的影响效果；当诱变浓度≥1.00%时，诱变时间≥10 h的影响效果均显著低于诱变时间为4 h的诱变效果。

2.2.2 诱变浓度对西瓜种子发芽率的影响 相同诱变时间条件下，研究EMS的诱变浓度对西瓜种子发芽率的影响发现，当诱变时间为4 h时，诱变浓度为0.40%和1.00%的西瓜种子相对发芽率与对照相比无显著差异，而诱变浓度分别为1.20%、1.40%、1.60%和2.00%的西瓜种子相对发芽率均显著低于对照（图1）；当诱变时间为10 h和12 h时，诱变浓度为0.40%的西瓜种子相对发芽率与对照相比均无显著变化，但1.00%～2.00%的西瓜种子相对发芽率都比对照低，且都达到了显著水平（图2、图3）；诱变14 h和16 h时，诱变浓度0.40%～2.00%的西瓜种子相对发芽率都显著低于对照（图4、图5）。由此可见，诱变时间和诱变浓度协同影响EMS的诱变效果，诱变时间一定时，诱变浓度越高西瓜种子的相对发芽率越低；与对照相比，诱变时间较短、诱变浓度较低时对西瓜种子相对发芽率的影响不大，诱变浓度越高，影响越显著；当诱变时间较长时，低浓度的诱变效果依然不显著，但随着诱变浓度的增大，影响效果越来越明显，且均能够达到显著水平；当诱变时间足够长时，即使诱变浓度较低，诱变效果也较显著。