广西厚皮甜瓜根腐病病原菌鉴定及抗病种质筛选

摘    要：根腐病是近年上升为广西地区大棚厚皮甜瓜生产上的重要病害，严重影响甜瓜产业的健康发展。为明确该病害病原菌的分类地位并获得抗病种质材料，对病原菌进行分离纯化和致病性测定，结合形态学和分子生物学特征对病原菌进行分类鉴定，并通过苗期抗病性鉴定方法筛选抗病种质材料。结果表明，致病菌株的菌落和分生孢子形态特征与前人报道的腐皮镰孢菌（Fusarium solani）一致。基于rDNA-ITS序列构建系统发育树，致病菌株与腐皮镰孢菌聚于同一最小分支，据此将广西厚皮甜瓜根腐病的病原菌鉴定为腐皮镰孢菌。从27份厚皮甜瓜种质材料中，筛选到抗性水平为高抗的材料3份，分别为M87、M102和M125；抗性水平为抗的材料6份，分别为M23、M78、M84、M100、M112和M123。明确了广西地区的根腐病病原菌种类，筛选出高抗根腐病的厚皮甜瓜种质资源，为选育抗根腐病的厚皮甜瓜新品种奠定了基础。

关键词：厚皮甜瓜；根腐病；分离鉴定；腐皮镰孢菌；抗病性

中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2022）04-027-06

Pathogen identification and disease resistant germplasm screening of melon root rot in Guangxi

YE Yunfeng1， XIE Huayun1， DU Chanjuan2， LI Tianyan1， ZHAO Tingchang3， YANG Di2， QIN Sihua1， HUANG Jinyan1， HONG Rixin1， HE Yi1， FU Gang2

（1. Horticultural Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， Guangxi， China; 2. Institute of Plant Protection， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007，Guagnxi， China; 3. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100093， China）

Abstract： Melon root rot has become an important disease in Guangxi in recent years， which seriously affects the healthy development of melon production. In this study， the pathogen was isolated and purified， the pathogenicity was tested， and identification was performed using both morphological and molecular characteristics. Furthermore， melon germplasm materials were screened for resistance by seedling tests. The results showed that the morphological characteristics of colony and conidia of the pathogenic strains were consistent with those of Fusarium solani. The phylogenetic tree constructed based on rDNA-ITS sequence show that the pathogenic strains and F. solani clustered in the same smallest branch. Therefore， the pathogen causing melon root rot in Guangxi was F. solani. Among 27 melon germplasm tested， M87， M102 and M125 showed high resistance level to the pathogen， and M23， M78， M84， M100， M112 and M123 showed resistant level. The pathogen species of melon root rot in Guangxi area was determined， and the resistant melon germplasm were identified in this study. Our research laid the foundation for the breeding of melon varieties resistant to root rot.

Key words： Muskmelon; Root rot; Isolation and identification; Fusarium solani; Disease resistance

厚皮甜瓜（Cucumis melo L. ssp. melo）是广西地区重要的园艺作物和经济作物，栽培面积约0.67万hm2，南宁市和北海市为主要种植区，柳州市、来宾市、桂林市等地区也有少量种植。在广西，厚皮甜瓜必须在保护地内种植才能获得成功[1]。温暖湿润的亚热带气候使得甜瓜在该地区每年可以种植2茬，但高温多雨的气候特点，加之2茬种植缺乏轮作机制，致使该地区甜瓜病害发生程度远高于北方地区，土传病害尤甚。近年来，甜瓜根腐病发生严重，并感染所有当地主栽品种，造成大量植株在瓜采收前10～15 d开始整株萎蔫枯死，病株果实不能正常膨大和成熟，品质和产量显著下降。发病率普遍达20%以上，严重的大棚发病率在80%～100%，减产20%～40%，严重制约了广西甜瓜产业的健康发展。

我国其他地区也有甜瓜根腐病发生的报道。20 世纪80 年代末，该病害首先在新疆喀什地区巴楚、伽师、岳普湖等县开始发生，90 年代初迅速传遍喀什地区各县市，重病田发病率达100%，造成毁灭性损失[2]。20世纪90年代至21世纪初，山东费县甜瓜根腐病造成20% 以上的减产[3]。甜瓜根腐病蔓延快、危害大、造成的损失重，于21世纪初发展成为我国西北和东部地区的重要病害之一[4]。

目前，国内已报道能引起甜瓜根腐病的病原菌有多种，分别是腐皮镰孢菌（Fusarium solani）[4-6]、黑点根腐病菌（Monosporascus cannonballus）[7]、黑腐病菌（Thielaviopsis basicola）[8]和尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）[9]等。国外报道的甜瓜根腐病菌主要有黑点根腐病菌（M. cannonballus）[10-12]、腐皮镰孢菌（F. solani）[13-14]、瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和层出镰刀菌（F. proliferatum）[15]等。而引起广西地区厚皮甜瓜根腐病的病原菌分类地位尚未明确。

甜瓜根腐病属于土传病害，防治困难。目前，尚无高效防治方法，而筛选抗病种质资源、选育和应用抗病品种，是最安全、有效的防治措施。国内外目前关于甜瓜根腐病抗源筛选研究的报道极少。仅见国内的杨颖等[4]从薄皮甜瓜种质资源中鉴定筛选到高抗材料16份，为挖掘抗病基因资源改良厚皮甜瓜根腐病抗性打下了基础。国外未见有相关研究报道。

为了明确广西地区厚皮甜瓜根腐病病原菌的分类地位和筛选抗病种质材料，笔者对采集于厚皮甜瓜主产区南宁市和北海市的病样进行病原菌分离纯化，通过致病性测定试验确定病原菌株，结合形态学和分子生物学特征对病原菌进行分类鉴定。同时，通过苗期抗病性鉴定方法从厚皮甜瓜种质资源中筛选抗病材料，旨在为甜瓜根腐病的防治和抗病育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供致病性测定的厚皮甜瓜品种为北甜1号，是当地主栽品种之一，易感根腐病。供抗病性鉴定的27份厚皮甜瓜材料是由广西壮族自治区农业科学院园艺研究所通过多年自交纯化和筛选获得的纯系材料，编号分别为：M5、M23、M57、M63、M66、M73、M75、M77、M78、M79、M81、M84、M85、M87、M88、M90、M93、M95、M97、M100、M102、M106、M108、M112、M123、M125和M128。

1.2 病害症状观察及病样采集

2021年3—6月在厚皮甜瓜整个生长期观察甜瓜根腐病的发生发展情况，并进行记录和拍摄。在广西南宁市武鸣区和北海市银海区等厚皮甜瓜主产区采集病样，两地种植品种均为北甜1号，种植时间为3月上旬，株距0.6 m，行距1.0 m，武鸣区采样地连片种植面积6.7 hm²，采集病样6份，样品编号为T1～T6，银海区采样地连片种植面积10 hm²，采集病样6份，样品编号为 T7～T12。取样时注意区分根腐病和枯萎病病株，根腐病病株茎基部维管束不变褐或者变褐但不向茎蔓扩展，环境湿度大时，茎基部有白色霉状物，茎蔓裂口处无琥珀色胶状物溢出，病部无缢缩；枯萎病病株维管束变褐，逐步向茎蔓扩展，环境湿度大时，茎基部有白色或粉红色霉状物，茎蔓裂口处有琥珀色胶状物溢出，病部稍缢缩。

1.3 病原菌的分离纯化

采用组织分离法进行病原菌分离。从病株根部的病健交界处切取5 mm×3 mm×1 mm的组织块，75%乙醇消毒20 s，0.1%升汞消毒1 min，无菌水清洗4次，置于PDA 平板培养基上，每皿放3个组织块，每份样品分离3皿，28 ℃下培养4 d，选择出现率高且形态一致的菌落，采用单孢分离法进行菌株纯化。

1.4 病原菌的致病性测定

从纯化获得的菌株中选5株代表性菌株接种于PDA培养基上，28 ℃培养12 d，用无菌水将培养基上的分生孢子洗下，制成浓度为1 × 106个·mL-1的孢子悬浮液备用。甜瓜种子于32 ℃下催芽48 h后种于70孔的育苗盘上，于育苗棚内生长7 d后，甜瓜幼苗的子叶展平，将其从营养杯中轻柔拔出，将根部置于孢子悬浮液中浸泡15 min后再植入育苗盘中，以清水浸根的植株为对照，每个菌株接种20株幼苗，3次重复。用薄膜覆盖保湿48 h，温度保持在25～35 ℃。定期观察植株发病情况，确定发病症状与根腐病症状是否一致，如果一致，从发病组织上进行病原菌分离，并确定分离所得菌株与接种菌株形态特征是否一致，如果一致可确定为病原菌。

1.5 病原菌的分类鉴定

1.5.1    病原菌的形态学鉴定    将具有致病性的菌株接种至PDA 培养基上，28 ℃培养7 d，观察记录菌落生长情况和形态特征，在光学显微镜下观察产孢结构及分生孢子的形态，并测量50个分生孢子的大小。

1.5.2    病原菌的分子生物学鉴定    采用真菌DNA 提取试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司）对5个病原菌株的总DNA进行提取。使用通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4 （5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）对病原菌的核糖体转录间隔区序列（ITS）进行基因扩增。PCR 反应体系和反应程序参考叶云峰等[16]的方法。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测确认有目标条带后，委托北京擎科生物科技公司进行测序。测序结果在NCBI 数据库中进行BLAST同源性比对，并采用MEGA-X 软件的Neighbor Joining 法构建基于rDNA-ITS基因的系统发育树，以确定病原菌的分类地位。