长沙地区南瓜白粉病病原菌及种质资源抗性的鉴定

摘    要：为鉴定湖南省长沙市芙蓉区金山基地南瓜白粉病病原菌种类及生理小种，运用显微形态观察、分子生物学鉴定及国际通用的13个甜瓜生理小种鉴别寄主和鉴别标准体系等方法，对该地区的南瓜白粉病病原菌进行鉴定，并对90份南瓜种质资源的抗病性进行鉴定。结果表明，长沙地区南瓜白粉病病原菌为单囊壳白粉菌（Podosphaera xanthii），生理小种为2France；筛选出9份高抗种质，均为中国南瓜类型；筛选出20份高感种质，其中7份为中国南瓜类型，13份为印度南瓜类型。明确了长沙地区的白粉病病原菌种类及其生理小种，筛选出高抗白粉病的南瓜种质资源，为选育抗白粉病的南瓜新品种及抗病基因定位研究奠定了基础。

关键词：南瓜；白粉病；生理小种鉴定；抗病种质

中图分类号：S642.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2022）04-020-07

Identification of squash powdery mildew pathogen in Changsha and resistance germplasm screening

YAN Jiali， CHU Xiao， LI Hao， LIANG Shaohua， SUN Xiaowu

（College of Horticulture， Hunan Agricultural University/Engineering Research Center for Horticultural Crop Germplasm Creation and New Variety Breeding， Ministry of Education， Changsha 410128， Hunan， China）

Abstract： To identify powdery mildew physiological races at Jinshan station of Furong District， Changsha City， Hunan Province， the pathogens of squash powdery mildew were assayed by means of micromorphological observation， molecular biology identification and differential host testing， the 13 international commonly used melon differentials. Ninety squash accessions， both Cucurbita moschata and Cucurbita maxima， were tested for resistance to the pathogen. Our results suggested that the squash powdery mildew pathogen in this area was P. xanthii race 2France. Among the tested accessions 9 were highly resistant and were C. moschata. Of the 20 highly susceptible accession 7 were C. moschata and 13 were C. maxima. Our research determined the squash powdery mildew pathogen in Changsa and identified resistance germplasm. This laid foundation for resistant squash breeding and gene localization.

Key words： Pumpkin; Powdery mildew; Physiological race identification; Resistant germplasm

南瓜是葫芦科南瓜属（Cucurbita）一年生蔓生草本植物，是我国重要的瓜类作物，也是栽培最早的蔬菜作物之一，主要分为五大栽培种，即中国南瓜（C. moschata）、印度南瓜（C. maxima）、美洲南瓜（C. pepo）、黑籽南瓜（C. ficifolia）及灰籽南瓜（C. mixta）[1]。南瓜具有极高的经济价值、营养价值、药用价值、饲用价值和观赏价值[2-5]，深受广大消费者喜爱，在我国广泛种植。南瓜在我国农业种植结构调整和经济增收中起到了重要作用。自20世纪70年代以来，随着人们食物结构的改善和对南瓜营养成分及其保健价值的深入研究，南瓜种植面积逐年扩大，南瓜生产过程中各种病害也逐年加重。白粉病是南瓜生产中的主要病害之一，白粉病具有潜伏久、发病快、蔓延迅速等特点，防治不当，轻则减产20%～30%，重则造成植株死亡，严重影响南瓜的产量和品质[6]。

目前，引起瓜类白粉病的病原菌主要有3个属：白粉病菌属（Erysiphe）、内丝白粉病菌属（Leveillula）及单囊壳属（Podsphaera），6个种分别是E. cichoracearum、E. polygoni、E. polyphage、E. communis、L. taurica和P. xanthii。P. xanthii报道最多，其次为E. cichoracearum[7]。P. xanthii已发现有11个生理小种，分别是生理小种0、1、2US、2France、3、4、5、N1、N2、N3和N4[8]。

白粉病菌生理小种种类繁多，分化快。不同作物之间的白粉病生理小种相差甚远，同一作物在不同地区栽培，白粉病生理小种也不尽相同。准确预测和鉴定南瓜白粉病病原菌种类，并检测其生理小种的分化是解决南瓜白粉病防治难题的基础。2006年刘秀波等[9]对黑龙江地区侵染南瓜白粉病生理小种进行了鉴定，确定其为单囊壳白粉菌（P. xanthii），而2009年马鸿艳等[10]研究表明该地区的优势生理小种由2Frace转变为race1。随着现代分子生物技术的高速发展，基因序列比对等技术被应用于物种鉴定等相关领域，白粉病病原菌的鉴定方式也由最初的显微观察向分子鉴定方向逐步发展。包海青等[11]、王娟等[12]、咸丰等[13]利用显微观察和白粉病生理小种鉴别体系的方法分别对来自海南三亚地区、北京地区、陕西关中地区的南瓜白粉病菌进行鉴定，确定白粉病病原菌为单囊壳白粉菌（P. xanthii），其生理小种是2France。屈淑平等[14]、綦聪[15]通过形态观察、分子鉴定及白粉病生理小种鉴别体系的方法，鉴定出黑龙江省哈尔滨市香坊区南瓜白粉病病原菌为单囊壳白粉菌（P. xanthii），生理小种为2France。李书颉等[16]利用形态学和分子生物学的方法对内蒙古不同地区籽用美洲南瓜白粉病病原菌种类进行鉴定，确定内蒙古地区白粉病为单囊壳白粉菌（P. xanthii），初步确定存在小种4、2F、1和1个未知小种；夏伟伟等[17]通过形态观察、ITS序列比对以及生理小种鉴别体系推断安徽省合肥市长丰地区的南瓜白粉病为单囊壳病菌，生理小种是race1。

湖南作为南瓜的重要产区之一，目前关于湖南地区的南瓜白粉病鉴定和抗病种质筛选的研究较少，笔者以湖南省长沙地区为例，通过对湖南省长沙市金山基地南瓜白粉病病原菌的形态结构进行观察、扩增该白粉病病原菌ITS序列并进行比对，鉴定该地区的白粉病病原菌种类；其次采用国际通用的甜瓜白粉病生理小种鉴别寄主明确该地区的白粉病菌的生理小种，对90份南瓜种质资源进行白粉病抗性鉴定，筛选出高抗白粉病的种质资源，为南瓜白粉病的抗病基因定位及培育抗白粉病新品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2份易感病自交系和90份种质资源鉴定材料由湖南农业大学园艺学院瓜类工程技术研究中心和湖南雪峰种业有限公司提供。易感病自交系为新土佐父本（C. maxima Duch.）和蜜本（C. moschata Duch.），90份南瓜种质资源为36份中国南瓜类型和54份印度南瓜类型。2019年4月在长沙市芙蓉区湖南农业大学旁金山基地大棚种植南瓜自交系新土佐父本和蜜本，用于病原菌分离、鉴定及白粉病接种体系优化，2019年4月在邵东县九龙岭镇湖南农业大学南瓜实验基地大棚种植90份种质资源鉴定材料，用于抗性鉴定。

国际通用鉴别寄主：Iran H、Top Mark、Védrantais、PMR 45、PMR 5、WMR 29、Edisto  47、PI 414723、MR-1、PI 124111、PI 124112、PMR 6、Nantais Oblong，由北京大学现代农业研究院张兴平教授惠赠。甜瓜鉴别寄主均在人工气候箱中培养，用于白粉病生理小种鉴定。

白粉病病原菌取自2019年4月种植于湖南农业大学南瓜试验基地自然发病的南瓜植株叶片。

1.2 方法

1.2.1    白粉病病原菌分离纯化    2019年5月收集自然发病南瓜叶片白粉病单菌落，滴入2滴吐温20，制成2.5×105～5.0×105个·mL-1孢子悬浮液，喷施于南瓜健康幼苗植株叶片上，后置于28 ℃、湿度80%、光照度30 000 lx、光周期为12 h的人工气候箱中培养，经过5次分离纯化后利用易感病品种新土佐父本植株扩繁，活体保存，用于后续试验。

1.2.2    白粉病病原菌形态观察    参照马鸿艳等[10]的方法，利用KOH溶液观察纤维状体，取白粉病病原菌的分生孢子于载玻片上，滴加1滴3% KOH溶液，盖上盖玻片，在10×40倍光学显微镜下观察白粉病孢子中是否存在纤维状体。二孢白粉菌G. cichoracearum的分生孢子呈细长圆柱形，没有纤维状体。单囊壳白粉菌P. xanthii的分生孢子呈椭圆形，有发达的纤维状体。

1.2.3    白粉病病原菌分子鉴定    白粉病病原菌DNA提取：用真菌DNA小量提取试剂盒（天漠生物）提取白粉病病原菌的DNA。

ITS序列PCR扩增引物与程序：利用真菌核糖体ITS区段通用引物ITS 1、ITS 4，序列为：ITS 1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS 4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR体系为50 μL体系：DNA模板1.25 μL，上下引物各2.5 μL，2×Rapid Taq Master Mix （Vazyme）25 μL，ddH2O 18.75 μL。PCR反应条件为：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s，退火50 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，35个循环；再延伸72 ℃，10 min。

凝胶电泳检测：取5 μL PCR产物，核酸染料染色，1%琼脂糖凝胶电泳检测，通过琼脂糖凝胶成像系统观察成像结果。

PCR产物测序：将PCR产物原液送至北京擎科生物有限公司进行正反双向测序。

序列分析：将南瓜白粉病病原菌ITS序列在NCBI核酸数据库中BLAST比对，使用DNAMAN软件进行序列对比分析，构建系统发育树。

1.2.4    白粉病病原菌生理小种鉴定    采用国际通用的13个甜瓜白粉病生理小种鉴别寄主。通过寄主分析不同白粉病病原菌生理小种抗感反应以区别本试验中感染白粉病病原菌的生理小种，寄主对不同生理小种抗感反应表现见表1，每个鉴别寄主种植10株。待寄主材料第3片真叶展开时即可接种，取分离纯化后南瓜白粉病病原菌于清水中，滴加2滴吐温20，制成浓度为2.5×105～5.0×105个·mL-1的悬浮液，用毛刷蘸取菌液，均匀涂抹在寄主叶片正面。接种后保持昼/夜温度26 ℃/16 ℃，相对湿度75%。接种后切忌在叶片上浇水，浇水和施肥从穴盘底部进行。接种10 d后调查发病情况，接种叶片出现白色分生孢子层的为感病；接种叶片无症状或出现褐色坏死病斑的为抗病。

1.2.5    南瓜种质资源白粉病抗性鉴定    2019年6月在湖南农业大学瓜类工程技术研究中心邵阳基地大棚中种植南瓜材料，在成株期对90份南瓜种质资源喷施浓度为2.5×105～5.0×105个·mL-1的白粉病孢子悬浮液，接种后15 d对南瓜病情划分等级，计算病情指数，根据病情指数计算结果判断种质资源抗性表现。鉴定标准见表2，病情指数（DI）计算如下[16]：

DI=∑（sini）×（5N）-1×100。

式中，si为发病等级，ni为相应发病等级植株数目，N为调查总株数观测量。

0＜DI≤20时为高抗材料；20＜DI≤40 时为抗病材料；40＜DI＜60时为中间型材料；60≤DI＜80是为感病材料；DI≥80为高感材料。