西瓜枯萎病尖孢镰孢菌生理小种3初报

摘    要：为明确宁夏回族自治区西瓜枯萎病致病菌，2021年在银川市贺兰县的商品西瓜种植基地采集到典型枯萎病病株，对病原菌分离纯化，测定其致病性;利用形态学特征和EF-1α基因序列分析法鉴定该病原菌种类，并利用西瓜鉴别寄主确定生理小种。结果表明，菌株NXWFW008能够使Black Diamond、Crimson Sweet和Calhoun Gray 100%枯萎死亡，且在PI 296341-FR上引起93.75%的发病率，因此鉴定该病原菌为尖孢镰孢菌西瓜专化型3号小种（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，race 3），生理小种3侵染导致的西瓜枯萎病为国内首次报道。

关键词：西瓜;枯萎病;生理小种3

中图分类号：S651 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2022）07-013-06

First report of Fusarium oxysporum f. sp. niveum Race 3 causing wilt of watermelon

WANG Guan LI Xiaoni YANG Wanbang XUE Lifang ZHANG Xingping LI Jianshe DENG Yun

（1. School of Agriculture， Ningxia University， Yinchuan 750021， Ningxia， China; 2. Peking University Institute of Advanced Agricultural Sciences， Weifang 261000， Shandong， China; 3. Institute of Horticulture， Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Yinchuan 750004， Ningxia， China）

Abstract： In order to identify races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in Ningxia recovered from watermelon seedlings. The disease plants were collected from a commercial watermelon production field in Helan， Yinchuan city in 2021. The pathogenic strains were isolated and pathogenicity was determined， using morphological characteristics and EF-1α gene sequence analysis to identify the pathogenic species and races were identified by using the watermelon identification hosts. The results indicated strain NXWFW008 caused 100% wilt and death of Black Diamond， Crimson Sweet and Calhoun Gray and 93.75% disease incidence on PI296341-FR， thus the strain was identified as FON race 3， race 3 infestation causing watermelon wilt is the first report in China.

Key words： Watermelon; Fusarium wilt; Race 3

西瓜（Citrullus lanatus L.）是一种重要的经济作物，在全世界广泛种植，中国是世界上最大的西瓜生产与消费国。枯萎病是西瓜的主要病害之一，给西瓜生产造成严重损失。尖孢镰孢菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，FON）是西瓜枯萎病的主要致病菌[1]，存在明显的种内分化，根据其对不同抗病品种的致病力，划分为4个生理小种，分别是生理小种0、1、2和3[2]。

宁夏回族自治区是我国著名的压砂西瓜和夏季西瓜产区，由于长期的连作，该地区西瓜枯萎病发病日益严重，然而宁夏地区西瓜枯萎病致病病原菌鉴定未见研究报道。迄今为止，国内报道了4个生理小种中的3个，分别为小种0、1和2，生理小种3尚未见报道。其中生理小种0在河北[3]、武汉[4]和安徽[5]被报道。生理小种1在中国是优势小种，已在河北[3]、湖北[4]、新疆[6]、黑龙江[7]、山东[8]和北京[9]被报道。而生理小种2仅在河北[3]被报道。Zhou等[10]首次报道了在美国马里兰州引起PI 296341-FR枯萎病发病率高于78%的病原菌，并将其鉴定为新的生理小种，即生理小种3。

2021年笔者在宁夏回族自治区银川市贺兰县金山村金城5号商品西瓜生产基地观察到典型的枯萎病病株，该品种高抗枯萎病生理小种1[11]。为了明确该病害的病原种类，笔者采集典型发病植株进行病原菌分离纯化，采用形态学和分子生物学方法进行病原菌鉴定，并利用西瓜鉴别寄主接种进行生理小种鉴定，为进一步防治提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试病样：2021年7月从宁夏回族自治区银川市贺兰县金山村商品西瓜生产基地采集具有典型发病症状的西瓜植株。西瓜品种为金城5号（由中卫市金城种业有限责任公司选育），高抗枯萎病生理小种1[11]。鉴别寄主：Black Diamond、Crimson Sweet、Calhoun Gray和PI 296341-FR，由国家西甜瓜种质资源中期库友情提供。对照菌株：尖孢镰孢菌西瓜专化型生理小种2（NXWFW011），与供试病样分离自同一地块，经鉴别寄主鉴定为生理小种2。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离纯化 将采集到的发病植株沿茎基部剪下，用清水清洗干净后，将样品置于75%酒精中浸泡30 s，然后用无菌水冲洗3次，灭菌滤纸吸干表面水分后，从病健交界处切取30 mm2的小块组织，接于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上26 ℃黑暗培养4 d，选择形态与镰孢菌相似的菌落[12]，将分离菌株单孢纯化后转入PDA培养基保存备用。

1.2.2 病原菌致病性鉴定 2021年10—11月在山东省潍坊市北京大学现代农业研究院作物育种平台采用柯赫氏法则对分离菌株进行致病性验证。采用浸根法接种[13]，将处于子叶展平期的Black Diamond西瓜苗根系漂洗干净后，在6×106个孢子·mL-1的孢子悬浮液中浸根30 s，随后采用随机区组方法栽种于32孔穴盘中，基质经灭菌处理，在人工气候室中培养，温度26 °C/22 °C（日/夜），光照14 h/10 h（日/夜），相对湿度60%，以清水接种的幼苗作为对照，每个处理接种6株，3次重复。接种后的28 d内，持续观察幼苗发病情况以确认分离菌株的致病性。

1.2.3 病原菌形态学鉴定 将纯化好的病原菌接种至PDA平板上，26 ℃培养7 d，观察菌落形态;在100倍倒置显微镜下直接观察小型分生孢子的产生方式并拍照。然后依据相关分类方法进行种类鉴定[12]。

1.2.4 病原菌分子生物学鉴定 采用CTAB法提取病原菌基因组DNA，PCR扩增EF-1α区序列[14]。反应体系：DNA模板1 μL、10 μmol·L-1上下游引物各2 μL、2×Taq Plus PCR MasterMix（北京瑞博兴科生物技术有限公司）25 μL，加ddH2O至50 μL。扩增条件：94 ℃预变性90 s，92 ℃变性30 s，55 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环，最后72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至北京擎科生物科技有限公司测序。将得到的序列在NCBI中进行BLAST比对，初步明确病原菌种类。

1.2.5 病原菌生理小种鉴定 2021年11月中旬至12月底利用4个西瓜鉴别寄主Black Diamond、Crimson Sweet、Calhoun Gray和PI 296341-FR在北京大学现代农业研究院人工气候室中鉴定病原菌的生理小种。将分离菌株的孢子悬浮液浓度调整至6×106个孢子·mL-1，用同样的方法接种西瓜鉴别寄主[13]，采用随机区组方法以清水和生理小种2菌株接种作为对照，每个处理接种12株，3次重复，用灭菌基质栽种于32孔穴盘内。接种后培养条件同上，在接种后的28 d内持续观察发病情况。根据分离菌株对鉴别寄主的致病反应，鉴定其生理小种。

1.2.6 病情分级标准及数据统计 统计时将西瓜枯萎病划分为7个等级，0级：无感染症状;1级：子叶边缘黄化，生长正常;3级：子叶枯萎，生长发育变缓;5级：植株失水，表现出枯萎症状;7级：整株枯萎死亡，根据发病级数，对鉴别寄主的单株进行表型判断，0～3级为抗病，5～7级为感病。植株发病率=（感病株数/调查总株数）×100%，使用Excel 2019统计感病植株数量并计算发病率，利用SPSS 26对发病率进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 病害症状

由图1可以看出，在发病地块，西瓜感病植株呈簇状或“热点”分布，植株枯萎死亡。感病植株根系变成深褐色，根系逐渐坏死，无新生根系，维管束变褐。

2.2 病原菌形态特征

由图2可以看出，经分离纯化后，获得1个纯化菌株（NXWFW008）。菌株NXWFW008在PDA培养基上形成圆形菌落，气生菌丝生长旺盛缠绕成束，菌落边缘整齐，气生菌丝呈丝绒状，白色至淡粉色，培养基背面淡粉色;小型分生孢子数量多，椭圆形，卵形或肾形，0～1隔，以无隔为主，大小为（5.0～10.0） μm×（1.0～3.0） μm;大型分生孢子镰刀型，数量较少，孢子细而弯曲，两端均匀变尖，足胞明显，多为3～5隔，大小为（20.0～36.0） μm×（3.0～5.0） μm;产孢细胞在气生菌丝上侧生的分生孢子梗上形成，有稀疏分枝，单瓶梗，安瓿瓶形，较短，为典型的尖孢镰孢菌特征。

2.3 分离菌株的致病性

由图3可以看出，接种菌株NXWFW008导致西瓜感病品种Black Diamond呈典型的枯萎病症状，接种7 d后植株表现叶片轻度失水萎蔫，随后症状进一步发展，西瓜整株萎蔫，根及茎基部坏死致整株死亡（图3-b），与田间症状相同（图1-b）。接种清水对照植株没有任何枯萎症状（图3-a）。且从发病植株中重新分离出了接种菌株，菌落形态与NXWFW008一致，表明分离菌株NXWFW008是西瓜枯萎病的致病菌。

2.4 EF-1α基因序列分析

菌株NXWFW008的EF-1α基因序列比对分析结果表明，NXWFW008与Genbank序列登记号为MZ773247.1、MZ773246.1、MW505885.1和MW315889.1的参考菌株序列同源性均达99.7%，且依据最大似然法（ML）构建的系统发育树也显示，菌株NXWFW008与上述参考菌株聚为一支，自举支持率为100%，遗传关系近（图4）。因此，鉴定分离菌株NXWFW008为Fusarium oxysporum f. sp. niveum。

2.5 病原菌生理小种鉴定

由表1可以看出，4个鉴别寄主对不同生理小种的抗感反应，Black Diamond感所有生理小种，Crimson Sweet抗生理小种0，Calhoun Gray抗生理小种0和1，PI 296341-FR抗生理小种0、1和2。

接种菌株NXWFW008后，PI 296341-FR发病率高达93.75%，而Black Diamond、Crimson Sweet和Calhoun Gray完全感病，发病率均为100%，不同鉴别寄主发病率无显著差异（表1，图5），4个西瓜鉴别寄主均表现为高感病与生理小种3抗感反应一致。接种菌株NXWFW011后，Black Diamond、Crimson Sweet和Calhoun Gray100%发病死亡，而PI 296341-FR发病率为16.65%，表现为高抗。与NXWFW011（race 2）相比，菌株NXWFW008能够侵染PI 296341-FR且发病率高达93.75%，因此鉴定NXWFW008为生理小种3。