根际细菌LK2-3对黄瓜枯萎病的生物防治作用
作者： 张婉菊 谢太震 陈梦多 王艺茹 沈虎生 何梦菡 朴凤植 申顺善
摘 要：LK2-3菌株是从番茄根系分离的植物根际生防细菌。为探讨生防细菌LK2-3对黄瓜枯萎病的生防潜力，采用皿内对峙试验和孢子萌发试验，测定LK2-3对黄瓜枯萎病菌的抑制活性;通过盆栽试验验证其对黄瓜枯萎病的防治效果，并根据形态特征、生理生化特性和16S rRNA序列同源性分析进行鉴定。结果表明，LK2-3菌株对黄瓜枯萎病菌的菌丝生长和孢子萌发均具有显著的抑制作用;在盆栽试验中，LK2-3处理显著促进黄瓜生长，并对黄瓜枯萎病具有明显的防治效果，其防治效果达到88.89%。同时，LK2-3在黄瓜根系和根际土壤具有良好的定殖能力。将LK2-3菌株鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。综上所述，生防细菌LK2-3防治黄瓜枯萎病具有极大的潜力。
关键词：黄瓜;枯萎病;生物防治;枯草芽孢杆菌LK2-3;根际定殖;鉴定
中图分类号：S642.2+S476 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2022）07-025-06
Biocontrol effect of rhizosphere bacteria LK2-3 against Fusarium wilt of cucumber
ZHANG Wanju XIE Taizhen CHEN Mengduo WANG Yiru SHEN Husheng HE Menghan PIAO Fengzhi SHEN Shunshan
（1. College of Plant Protection， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）
Abstract：A promising biocontrol agent LK2-3 was isolated from roots of tomato. In order to study the biocontrol potential of strain LK2-3 against Fusarium wilt of cucumber， the antifungal activity of LK2-3 against Fusarium oxysporum was detected by in vitro and pot experiments. The results showed that， in vitro experiment， LK2-3 had a significant inhibitory effect on the mycelial growth and germination of spore of F. oxysporum. In the pot experiment， LK2-3 significantly promoted the growth of cucumber and had obvious control effect on Fusarium wilt of cucumber， and its control effect reached 88.89%. Meantime， LK2-3 had a good colonization ability in cucumber root and rhizosphere soil. In addition， based on the morphological， physiological characteristics and 16S rRNA sequence analysis， the strain LK2-3 was identified as Bacillus subtilis. In summary， LK2-3 has good biocontrol potential for Fusarium wilt of cucumber.
Key words：Cucumber; Fusarium wilt; Biological control; Bacillus subtilis LK2-3; Rhizosphere colonization; Identification
黄瓜枯萎病是由无性态真菌尖孢镰孢菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）引起的一种毁灭性土传病害，在黄瓜整个生育期均能产生危害，在露地和保护地栽培中均可发生，尤其是在黄瓜连作地发生更为严重[1-2]。目前，黄瓜枯萎病的防治以化学防治为主，但使用化学农药容易产生抗药性而导致防效降低，且化学农药易残留，容易引起环境污染和人畜安全等问题[3]。植物病害的生物防治具有安全、无毒、环保等特点，弥补了植物病害传统防治方法的缺陷，在农业生产上具有十分广阔的应用前景，尤其在蔬菜病害防治方面优势显著[4-5]。目前，利用生防细菌防治黄瓜枯萎病的研究比较活跃，已报道的黄瓜枯萎病生防细菌主要有解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）等芽孢杆菌属和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、弗雷德里克斯堡假单胞菌（Pseudomonas frederiksbergensisi）等假单胞菌属。如，解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）SF1103和枯草芽孢杆菌（B. subtilis）SF1104对黄瓜枯萎病菌具有较强的拮抗能力，能有效防治黄瓜枯萎病，同时对黄瓜的生长有促进作用[6];蜡样芽孢杆菌（B. cereus）Y3F能分泌抑制病原菌生长的活性物质，显著降低黄瓜根际土壤真菌和尖孢镰孢菌数量[7];铜绿假单胞杆菌（P. aeruginosa）BA5对黄瓜枯萎病菌菌丝抑制率达58.33%，能有效防治黄瓜枯萎病[8];荧光假单胞杆菌（P. fluorescens）对黄瓜枯萎病菌菌丝抑制率达87.04%，降低了黄瓜枯萎病发病率[9];弗雷德里克斯堡假单胞菌（P. frederiksbergensisi）33-1对黄瓜枯萎病具有很好的防治效果，防效达86.95%，同时对黄瓜具有促生作用[10]。
目前，在生产上应用于黄瓜枯萎病生物防治的高效生防菌株还是有限。笔者从番茄根系分离筛选出生防细菌LK2-3，研究其对黄瓜枯萎病菌的抑制效果，确认其对黄瓜枯萎病的防治效果、对黄瓜的促生效果及其根际定殖能力，并对其进行鉴定，为黄瓜枯萎病的生物防治提供生防资源。
1 材料与方法
1.1 材料
供试菌株LK2-3为2020年分离自河南省驻马店采集的健康番茄根系，采用逐步提高诱导浓度的方法获得稳定抗利福平（100 μL·mL-1）的菌株，保存于-80 ℃超低温冰箱;黄瓜枯萎病菌尖孢镰孢菌黄瓜专化型（F. oxysporum f. sp. cucumerinum）由河南农业大学植物保护学院植物病害生物防治研究室提供;供试黄瓜品种为寒育6号，是河南豫艺种业科技发展有限公司选育的抗枯萎病品种;供试培养基为TSA培养基（TSB 30 g，琼脂18 g，蒸馏水1000 mL）、PDA培养基（土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，蒸馏水1000 mL）、PDB培养基（土豆200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1000 mL）和PDK培养基（PDB 20 g，蛋白胨10 g，琼脂18 g，蒸馏水1000 mL）。
1.2 方法
试验于2021年1—12月在河南农业大学植物保护学院植物病害生物防治研究室进行。
1.2.1 LK2-3菌悬液的配制 将LK2-3在TSA培养基上培养72 h后，用0.1 mol·L-1 MgSO4溶液配制成108 cfu·mL-1的LK2-3菌悬液。
1.2.2 尖孢镰孢菌孢子悬浮液的配制 将在PDA培养基上培养的尖孢镰孢菌菌饼接种到PDB培养基，在恒温摇床（28 ℃，160 r·min-1）培养5 d，然后用无菌水稀释配制成1×107孢子·mL-1的孢子悬浮液。
1.2.3 LK2-3对黄瓜枯萎病菌的抑制活性测定 采用平板对峙法测定LK2-3对黄瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制效果。将尖孢镰孢菌菌饼放在PDK培养基平板中央，在距离菌饼25 mm处接种LK2-3，置于28 ℃培养箱中培养5 d后调查抑菌带大小。采用悬滴法测定LK2-3对黄瓜枯萎病菌孢子萌发的抑制活性。取等量的LK2-3菌悬浮液（108 cfu·mL-1）和尖孢镰孢菌分生孢子悬浮液混合均匀，取20 μL滴到凹玻片上，置28 ℃恒温培养箱里保湿培养，每隔2 h在显微镜下观察分生孢子萌发情况，每次共观察3个视野，每个视野大概100个分生孢子，以无菌水和尖孢镰孢菌分生孢子悬浮液混合作对照。
孢子萌发率/%= 萌发孢子数/调查孢子总数×100;
孢子萌发抑制率/%=（对照萌发率-处理萌发率）/对照萌发率×100。
1.2.4 LK2-3的防病效果和促生效果测定 采用盆栽试验测定LK2-3对黄瓜枯萎病的防治效果和对黄瓜的促生效果。试验设4个处理，即清水处理（CK）、LK2-3处理、枯萎病菌处理（FOC）、枯萎病菌和LK2-3处理（FOC+LK2-3），随机区组设计，每处理3次重复，每个重复15株。将2片真叶的黄瓜苗移栽至花盆（直径9 cm），用LK2-3菌悬液（108 cfu·mL-1）进行灌注处理（100 mL·株-1），然后沿花盆边缘灌注接种黄瓜枯萎病菌孢子悬浮液（10 mL·株-1），在育苗室培育15 d后，按照分级标准调查枯萎病发病程度，并计算病情指数和防治效果。同时，测定黄瓜株高、茎粗、叶鲜质量、叶干质量、根鲜质量、根干质量等黄瓜生育指标。调查黄瓜枯萎病分级标准：0级为植株正常生长，不发病;1级为植株有≤1/4的叶片萎蔫;2级为植株有>1/4、≤2/4的叶片萎蔫;3级为植株有>2/4、≤3/4的叶片萎蔫;4级为植株萎蔫死亡[11]。
病情指数=∑（各级病株数×各级代表值）/（调查总株数×最高级代表值）×100;
防治效果/%=（对照病情指数-处理病情指数）/ 对照病情指数×100。
1.2.5 LK2-3的根际定殖密度测定 采用稀释涂布平板法测定LK2-3的根际定殖密度，用LK2-3菌悬液（108 cfu·mL-1）进行灌根处理（100 mL·株-1）15 d后测定LK2-3在黄瓜根系和根际土壤的定殖密度。测定根系的定殖密度：轻轻拔出黄瓜根系，用流水冲洗干净，吸干根表面的水分，称取1 g根系，研磨后用0.1 mol·L-1 MgSO4溶液稀释一定浓度涂抹在添加利福平的TSA培养基平板上，置于28 ℃恒温箱培养48 h，待形成菌落，检测菌落数并推算出在黄瓜根系的LK2-3定殖密度;测定根际土壤中的定殖密度：取1 g根际土壤，用0.1 mol·L-1 MgSO4溶液稀释一定浓度涂抹在添加利福平的TSA培养基平板上，培养同上，待形成菌落，检测其定殖密度。
1.2.6 LK2-3的鉴定 LK2-3菌株的形态特征及生理生化特性主要参考《伯杰氏细菌学鉴定手册》[12]，按照常规细菌学方法进行鉴定。将LK2-3菌株在TSA培养基上划线培养72 h后，观察单菌落的形态、颜色、大小、透明度、光泽及边缘特征等。采用革兰氏染色法观察LK2-3菌体形态[12]。
16S rRNA序列同源性分析：将LK2-3在TSA培养基上培养2 d，挑取细菌单菌落提取RNA，采用通用引物27 f（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和1492 r（5’-TACGGHTACCTTACGACTT-3’）进行PCR扩增，PCR 扩增采用50 μL反应体系（DNA：1 μL，Primer：各1 μL，Mix：25 μL，ddH2O：22 μL），PCR 反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环后72 ℃延伸10 min。PCR产物送生物公司测序，测序结果利用 NCBI BLAST 进行序列分析，并采用MEGA 7.0 软件构建系统发育树。