基于拮抗及ITS序列分析的河南香菇主产区种质资源鉴定及遗传多样性分析

摘    要：应用核糖体基因转录间隔区域（Internal Transcribed Spacer，ITS）序列及拮抗法对河南食用菌主产区香菇栽培菌株进行鉴定，并分析遗传多样性。以收集的41个香菇栽培菌株为样本，两两之间进行拮抗测试分析，提取DNA并进行PCR扩增、回收、测序，采用比对邻接法（neighbor-joinging，NJ）构建系统进化树。结果表明，16个差异菌株拮抗现象明显，其余菌株无拮抗或者拮抗不显著，41个香菇菌株初步分为16个不同菌株及7个不同亚种;ITS序列比对及系统发育分析将41个香菇品种聚为独立进化的4个大类，即3个不同的菌株和8个不同的亚种，种内遗传距离为0.000 0～0.006 5，与Pleurotus ostreatus（KY962509）种间遗传距离为0.374 0。综上所述，“ITS+拮抗法”结合可以明确区分菌株间拮抗、无拮抗及拮抗不明显现象基因序列的相似度、遗传距离的差异及亲缘关系的远近，为香菇品种的鉴定提供理论支撑。

关键词：香菇;ITS;拮抗鉴定;遗传多样性分析

中图分类号：S646 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2022）07-031-08

Identification of germplasms and genetic diversity of Lentinus edodes from main production areas in Henan province based on antagonism and ITS sequence analysis

CUI Xiao LIU Qin KONG Weili ZHANG Yuting HU Sujuan WANG Yanpo KANG Yuanchun KONG Weiwei YUAN Ruiqi

（1. Institute of Plant Nutrition， Agricultural Resources and Environmental Science， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. Xixia Edible Fungus Production Office， Xixia 474599， Henan， China）

Abstract：Internal Transcribed Spacer （ITS） sequence and antagonism were used to identify and analyze the genetic diversity of Lentinus edodes isolated from the main producing area of edible fungi in Henan. The 41 cultivated L. edodes strains from the main producing areas of edible fungi in the province were collected as samples， and the antagonism test was conducted between pairs， and DNA of the samples were extracted， amplified by PCR， recovered and sequenced， and a phylogenetic tree was constructed by neighbor-joining （NJ） method. The results showed that： The antagonism was obvious in 16 different strains， while the rest showed no or insignificant antagonism， and the 41 L. edodes strains were divided into 16 different strains and 7 different subspecies; ITS sequence alignment and phylogenetic analysis clustered 41 L. edodes strains into independently evolved 4 broad classes， 3 different strains and 8 different subspecies and the intraspecific genetic distances were between 0.000 0 and 0.006 5， of which the interspecific genetic distance with Pleurotus ostreatus（KY962509） is 0.374. The combination of “ITS + antagonism” method could clearly distinguish the similarity of gene sequence of the phenomenon of antagonism， no antagonism and antagonism of which is notobvious， genetic distance and relationship between strains， which provide theoretical support for the identification of L. edodes varieties.

Key words： Lentinus edodes; ITS; Antagonistic identification; Genetic diversity analysis

香菇（Lentinus edodes）隶属于真菌门担子菌纲香菇属[1]，是世界上重要的食用菌栽培品种之一。中国是世界上最大的香菇生产国，2020年我国香菇总产量为1 188.21万t[2]，占全国食用菌生产总量（4 061.43万t）的29.26%。我国香菇生产基地分布于河南、河北、湖北、浙江、福建、贵州、黑龙江等省，其中，河南省2020年香菇产量为365.08万t，占河南省食用菌产量（561.85万t）的64.98%，居全国第一位[2]。河南省香菇栽培主要分布在南阳西峡、南召、桐柏，三门峡卢氏、灵宝，驻马店泌阳、驿城区，平顶山汝州、鲁山等地，栽培规模接近30亿棒。但生产中由于引种混乱，同名异种、同种异名现象频发，伤农害农事件屡次出现。河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所食用菌团队前期采用模糊数学和聚类分析的方法对河南省种质资源库保存的香菇表型性状进行评价，但无法确定品种基因序列遗传差异[3]，厘清菌株之间的差异性、避免香菇菌株的混淆是推动香菇产业健康发展的必要路径。随着分子生物技术的发展，SSR[4-5]、RAPD[6-7]、ITS[8-11]等方法在香菇、平菇、灵芝等食用菌种群的系统发育和遗传多样性鉴定中广泛应用。而拮抗法是传统的菌株鉴定方法，传统鉴定和分子生物学鉴定相结合能够较好地鉴定食用菌种内种质资源的特异性。前期，笔者已通过“拮抗+ITS”序列分析相结合的方法鉴定了54个平菇菌株[12]，笔者以河南省内香菇生产大县的不同菌种企业和栽培基地收集到的41份香菇菌株为研究对象，应用“ITS+拮抗”相结合的方法进行菌种鉴定和遗传多样性分析，进而为香菇种质资源鉴定提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

参试菌株为收集的河南省内栽培香菇菌株41个，编号及来源见表1。

母种培养基为PDA综合培养基，购自北京奥博星生物技术有限责任公司的PDA基础培养基40 g·L^-1，蛋白胨2 g·L^-1，KH₂PO₄ 1 g·L^-1，MgSO₄ 0.5 g·L^-1。主要试剂及引物为Taq PCR Master Mix聚合酶、DNA纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、PCR 扩增试剂及4sGelRed染液，均购自上海生工有限公司;pMD-18T载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞购自宝生物工程（大连）有限公司;rDNA ITS 分析所用的ITS 通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 拮抗试验 2021年6—8月收集河南省科研单位、企业及种植户栽培的香菇品种，2021年10月，在河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所将收集到的41份香菇菌株在PDA综合培养基上经活化后，采用直径5 mm的打孔器打取各菌株种块于直径90 mm培养皿内对峙培养，每皿放置6个菌块，种块间距1.0 cm，每个菌株3次重复，于25 ℃培养7 d，按照拮抗试验国家标准的方法观察记录41份参试菌株两两之间的拮抗线的形态。

1.2.2 DNA提取 将培养的香菇菌丝体置于1.5 mL无菌离心管中，在全自动快速研磨仪中研磨成粉，提取各样品的基因组DNA，基因组DNA提取采用微波法[13]，采用1.0%的琼脂糖凝胶检测DNA样品质量和浓度，−20 ℃保存备用。

1.2.3 PCR扩增 选用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）[14]。PCR反应体系：DNA模板1.0 µL，Taq PCR Master Mix聚合酶12.5 µL，上下游引物（10 µmol·L^-1）各1.0 µL，ddH₂O 4.5 µL。反应程序：95 ℃5 min，95 ℃ 1 min，58 ℃30 s，72 ℃50 s，72 ℃10 min，30个循环。

1.2.4 PCR产物检测及测序扩增 反应完毕后，取5.0 μL 的PCR产物与1.0 μL 4sGelRed染液混合，加样于琼脂糖凝胶点样孔中进行电泳，电泳结束后，全自动凝胶成像分析仪JS-680D下检测扩增条带。回收正确的扩增条带（700～800 bp）连于pMD-18T载体上，将连接产物转化于大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α菌株感受态细胞，涂布在含有Amp的LB固体培养基上，37 ℃培养过夜，菌落PCR法验证单克隆大肠杆菌菌株，将验证正确的大肠杆菌菌株送北京六合华大基因科技有限公司测序。

1.2.5 数据分析 测序获得的序列经DNAMAN软件多序列比对重排后，于NCBI数据库上比对，采用MEGA-X软件计算遗传距离，以Genebank中平菇（Pleurotus ostreatus）为外类群，构建基于ITS序列的系统进化树[15]。

2 结果与分析

2.1 拮抗结果分析

41个香菇菌株共设计拮抗组合861组，拮抗现象明显的有480组，占55.75%;拮抗现象不明显的有298组，占34.61%;无拮抗的有83组，占9.64%。其中，香9608（LE-1）、香931-2（LE-2）、庆元2号（LE-10）、香939（LE-13）、香LS-1（LE-14）、灵仙1号-1（LE-25）、香931（LE-34）、香升龙1-1（LE-37）、香856（LE-38）、香泌阳18-1（LE-39）、泌阳17（LE-40）、香泌阳18-2（LE-41）之间无拮抗，与其他各菌株之间拮抗明显，表明这些菌株亲缘关系较近，初步鉴定为同一菌株;同理，朕迪CGL-10 （LE-20）、豫香1号（LE-31）之间无拮抗，与其他各菌株之间拮抗明显，表明这些菌株亲缘关系较近，为同一菌株;DM-18 （LE-24）、灵仙1号-3分（LE-27）之间无拮抗，与其他各菌株之间拮抗，明显被鉴定为同一菌株;灵仙1号（LE-4）、灵仙1号-5（LE-5）、雨花3号（LE-6）、申香215（LE-8）、朕迪XZL-3 （LE-17）、朕迪ZSL-8（LE-18）之间无拮抗，与其他各菌株间拮抗不明显，鉴定为同一菌株;L18（LE-3）、沪农1号（LE-9）、朕迪CGL-9（LE-19）、朕迪CGL-11 （LE-21）、朕迪DM-12 （LE-22）、朕迪DM-13 （LE-23）、灵仙1号-2（LE-26）、南山1号-3（LE-28）、香菇分（LE-29）、卢香（LE-30）、香808（LE-33）、香ZX-4（LE-35）、香939 1-2（LE-36）与其他各菌株之间拮抗明显，表明这些菌株亲缘关系较远;武香1号-2（LE-7）、香25（LE-11）、香27（LE-12）、香平顶18-04（LE-15）、朕迪XZL-2（LE-16）、夏1（LE-32）与其他各菌株间拮抗不明显，鉴定为疑似同一菌株。拮抗试验结果可将41个香菇菌株初步分为16个不同菌株及7个不同亚种（图1～2）。