96个大白菜品种根肿病抗性鉴定及位点检测

摘    要：为了明确大白菜抗根肿病基因类型和品种抗性特征之间的关系，利用同为4号生理小种的新野老菌和新野新菌，采用灌根法对96个大白菜品种进行抗病性鉴定，并利用CRa、CRb、CRc、Crr1、Crr2、Crr3等6个抗根肿病位点标记检测不同品种所含有的抗性位点。结果表明，农科一号、山地王1号、春美一号等31个品种对新野老菌和新野新菌均表现出抗性，且这些材料大多含有CRa和CRb抗病位点，个别品种含有Crr1、Crr2或Crr3抗病位点。只含有Crr2和CRb抗病位点的大白菜品种如Chiifu、德高荣耀、吉红娃娃、玲珑二号对新野老菌或新菌却表现出感病症状，笔者推测Crr2和CRb可能不是主要的抗病位点。此外，笔者发现只含有CRb位点的山地王2号B型对新野老菌和新菌均表现出抗性，说明该品种可能含有新的抗病基因。研究结果为大白菜抗根肿病种质资源鉴定及新品种选育奠定了基础。

关键词：大白菜;根肿病;抗性基因;生理小种

中图分类号：S634.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2022）08-027-08

Identification and detection of clubroot resistance loci of 96 Chinese cabbage cultivars resistance to Plasmodiophora brassicae

WEI Xiaochun1，2， YUAN Yuxiang1， ZHAO Yanyan1， YANG Shuangjuan1， WANG Zhiyong1， SU Henan1， LI Jundang1，2， LI Lin1， NIU Liujing1， ZHANG Xiaowei1

（1.Institute of Horticulture， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. School of Agricultural Science， Zhengzhou University， Zhengzhou 450001， Henan， China）

Abstract：In order to clarify the relationship between resistance gene types and resistance characteristics of Chinese cabbage cultivars， 96 Chinese cabbage cultivars were identified for resistance by root dipping method using new and old isolates of Xinye Plasmodiophora brassicaeis race 4 and six resistance loci including CRa， CRb， CRc， Crr1， Crr2 and Crr3 were used to detect the resistance loci of different varieties. The results showed that， 31 varieties， including Nongke 1， Shandiwang 1 and Chunmei 1， showed resistance to both new and old fungus Xinye isolates， and most of these varieties had CRa and CRb resistance genes， while some varieties had Crr1， Crr2， or Crr3 resistance genes. However， Chinese cabbage varieties having only Crr2 and CRb resistance loci， such as Chiifu， Degaorongyao， Jihongwawa and Linglong 2， showed susceptible symptoms to new or old  Xinye isolates. we speculated that Crr2 and CRb may not be the main resistance loci. In addition， we found that Shandiwang 2 typeB having only CRb loci showed resistance to both new and old Xinye isolates， indicating that there may be new resistance genes in Shandiwang 2 typeB. The results laid a foundation for the identification of germplasm resources and breeding of Chinese cabbage resistant to the disease.

Key words：Chinese cabbage; Clubroot; Resistance gene; Pathotype

大白菜原产于中国北方，是我国重要的露地蔬菜，素有菜中之王的美称[1]。根肿病是由鞭毛菌亚门芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae Woron.）侵染引起的土传病害，在许多国家都有发生[2]。根肿菌通过感染十字花科植物的根部，使之形成肿瘤或腐烂，最终导致整株植物枯萎甚至死亡[3]。

随着大白菜根肿病逐年加重，化学、生物及农业措施在防治根肿病中的效果呈下降趋势。从生态环境方面考虑，培育抗病品种将是解决根肿病的有效方法[4]。目前，在大白菜和欧洲芜菁上已定位了32个抗根肿病位点：Crr1a、Crr2、Crr3、CRa、CRb、CRc、CRd、CRk、CRs等[5]。研究较多的是CRa[6]、CRb[7]、CRc[8]、Crr1[9]、Crr2[9]、Crr3[10]位点。其中，CRa、Crr1a和CRbkato抗病基因已成功克隆且都为TIR-NB-LRR类抗病基因。抗病基因的克隆和抗病位点的鉴定为培育更好的大白菜抗病品种提供了依据[5]。河南省新野县大白菜种植面积较大，其面临根肿病的困扰日益严重，目前主要的根肿病菌株是4号生理小种新野新菌和新野老菌[11]。在本研究中，笔者利用新野老菌及新野新菌病原菌对96个大白菜材料进行接菌鉴定，同时，利用已报道的CRa、CRb、CRc、Crr1、Crr2、Crr3等6个标记对大白菜品种进行抗性位点检测，明确不同位点与根肿病抗性的关系，进而为选育抗根肿病大白菜资源提供分子标记基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2020年9—11月在河南省新野县河南省农业科学院园艺研究所叶类蔬菜研究室根肿病原圃开展试验，根肿病菌株分为新野老菌4号生理小种和新野新菌4号生理小种，96份大白菜材料由河南省农业科学院园艺研究所叶类蔬菜生物育种课题收集保存（表1）。

1.2 方法

试验材料的种植及鉴定均在河南省农科院园艺所新野县根肿菌病原圃进行，其中AKIMEKI为抗病对照，Chiifu和ECD05为感病对照，每份大白菜品种种植36棵。笔者采用苗期穴盘人工接种鉴定方法，设置了3次重复，制备1×107个·mL-1的根悬浮液，并使用灌根法[12]在播种当天及播种后第3天进行接菌处理。30 d后，开始对每株材料根部发病程度进行分级调查记录发病情况，并利用CRa、CRb、CRc、Crr1、Crr2、Crr3等6个抗根肿病位点标记进行基因型鉴定。

1.3 根肿病抗病性鉴定及病情分级

试验材料接菌处理30 d后调查发病情况，计算病情指数，评价品种的抗性。大白菜根肿病的鉴定标准如下[13]（表2）。

病情指数（DI）和病株率的计算公式如下：

病情指数=[Σ（各级病株数×相应级别）/（调查总株数×发病最高级别代表值）]×100。

病株率=（病株数/调查株数）×100%。

病情指数的划分标准为：高抗≤30.0;30.0<抗病≤40.0;40.0<低抗/低感≤50.0;50.0<感病≤80.0;高感>80.0。

[表2 大白菜根肿病发病级别鉴定标准

[发病等级 根部表型 0 根系正常无肿瘤，无病害症状。 1 侧根、须根有小肿瘤，主根未发生病害。 3 主根肿大，直径大于茎基部的1～2倍，主根症状较轻，须根和侧根有较多肿瘤。 5 主根肿大明显，直径大于茎基部的2～4倍，须根和侧根大部分有肿瘤 7 主根异常肿大，直径大于茎基部的4倍，侧根与须根肿大十分严重并与主根粘连形成肿瘤。 ]]

1.4 根肿病抗病基因检测

使用改良后的CTAB法提取大白菜基因组DNA，PCR反应总体积为20 μL，根肿病抗病位点CRa、CRb、CRc、Crr1、Crr2、Crr3引物、PCR体系及反应条件见表3。

2 结果与分析

2.1 大白菜品种抗病性鉴定

根据苗期接菌发病情况，将96份大白菜划分为3种不同的抗性类型：抗新野老菌和新野新菌类型，抗新野老菌不抗新野新菌类型，不抗新野老菌和新野新菌类型。其中抗新野老菌不抗新菌品种的比例高达61.46%，分别为秋利皇、金锦、CR-启航等59个品种;抗新野老菌和新野新菌品种比例为33.33%，分别为山地王2号、灿光CR-65、冬福春宝等32个品种;不抗新野老菌和新野新菌品种比例为5.21%，分别为吉红娃娃、德高荣耀、玲珑二号等5个品种（表4）。

2.2 大白菜品种抗病基因型鉴定

利用CRa、CRb、CRc、Crr1、Crr2、Crr3等6个根肿病抗病位点分子标记对96个大白菜品种进行抗病基因型鉴定，琼脂糖凝胶检测结果如下（表4）：CRa：57个品种检测到CRa抗性位点，占全部材料的59.38%;CRb：60个品种检测到CRb抗性位点，占全部材料的62.50%;CRc：20个品种检测到CRc抗性位点，占全部材料的20.83%;Crr1：14个品种检测到Crr1抗性位点，占全部材料的14.58%;Crr2：50个品种检测到Crr2抗性位点，占全部材料的52.08%;Crr3：4个品种检测到Crr3抗性位点，占全部材料的4.17%。部分琼脂糖电泳结果见图1所示。

不同大白菜品种的抗病位点存在较大差异，供试的96个品种中CR相春、春美二号、天香65未检测到抗病位点;Chiifu、宝根王（北京）、胜根CR1、根白金、西由铁根605检测到CRc抗病位点;CR根宝、天籁、文鼎春宝、胶研CR65检测到Crr1抗病位点;春美一号、金童四季、宝根王（韩国）、申荣八号、CR-578、韩峰、春锦检测到Crr2抗病位点;山地王2号B型，CR冬圣检测到CRb抗病位点，这类只检测到单一抗病位点或者未检测到抗病位点的材料约占全部材料的21.88%。AKIMEKI、CR白菜12-101、CR-元春等57个品种同时含有CRa，CRb抗病位点，约占全部材料的59.38%。同时这57个品种的一部分又检测到CRc抗病位点（如希望白菜F1），Crr2抗病位点（如农科一号），Crr3抗病位点（如金锦）;另有18.74%的品种同时包含CRc、Crr2抗病位点（如西由铁根CR108）或者Crr1、Crr2抗病位点（如西由铁根705）。96个大白菜品种大多能检测到2至4个抗病位点，其中CR春福含有的抗病位点最多，包含5个，分别是CRa、CRb、Crr1、Crr2、Crr3（表4）。笔者推测含有较多抗病位点的品种在理论上会对多个根肿病生理小种表现抗性，对单一生理小种的抗性也会更强。