西瓜新炭疽病菌的鉴定、生物学特性及药剂敏感性研究

摘    要：为了明确2018—2021年在吉林省及周边地区发现的一种西瓜炭疽病新病原菌的分类地位，探究其防治方法，采用组织分离法获得培养形状一致的52个菌株，柯氏验证结果表明其代表菌株具有致病性，结合形态学和分子生物学特征将该病原菌鉴定为菜豆炭疽菌Colletotrichum incanum。生物学特性观察结果表明：C. incanum菌丝生长的最适培养基为PDA，最佳pH值为5，最适氮源为甘氨酸，最适碳源为淀粉，最适温度为30 ℃，最适光照条件为全光照;产孢最适培养基为CMA，最适pH值为5，最佳氮源为甘氨酸，最佳碳源为麦芽糖，最适温度为10 ℃，在全黑暗条件下产孢最佳。采用菌丝生长速率法和孢子萌发法对该病原菌进行室内药剂敏感性测定。结果表明，在菌丝生长和孢子萌发方面，该病原菌对25%吡唑醚菌酯SC、350 g·L-1苯甲·嘧菌酯SC、560 g·L-1嘧菌·百菌清SC和40%嘧菌·戊唑醇SC敏感性均较好，可作为该病害防治的优先选用药剂。

关键词：西瓜炭疽病;Colletotrichum incanum;病原鉴定;生物学特性;药剂敏感性

中图分类号：S651 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2022）08-018-09

Identification， biological characteristics and fungicide susceptibility of the new pathogen Colletotrichum incanum of watermelon anthracnose

JIN Junyuan1， WANG Youxian2， LIU Qian3， SUN Lei1， BAI Qingrong1， ZHAO Tingchang4

（1. College of Plant Protection， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， Jilin， China; 2. Agricultural Comprehensive Administrative Law Enforcement Brigade of Jiaohe City in Jilin Province， Jiaohe 132500， Jilin， China; 3. Comprehensive Service Center of Heishui Town（Agricultural Technology Extension Station）， Taonan 137100， Jilin， China; 4. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100096， China）

Abstract： To clarify the taxonomic status and conduct research on prevention of a new pathogen of watermelon anthracnose in Jilin Province during 2018-2021， 52 isolates were collected by tissue isolate method with consistent culture characteristics and the representative strains were tested for pathogenicity by the Koch's postulate in this study. The pathogen was identified as Colletotrichum incanum by morphological characteristics and sequence analysis. The optimum culture medium， pH， carbon source， temperature and light of mycelial growth were PDA， pH 5， glycine， starch， 30 ℃ and full light， respectively. The optimal conditions of conidial production of C. incanum were CMA， pH 5， glycine， maltose， 10℃ and total darkness， respectively. Determination of indoor pesticide susceptibility of the fungus by mycelium growth rate method and conidial germination method. The mycelium and conidium of C. incanum were more susceptible to 25% pyrazoxystrobin SC， 350 g·L-1 difenoconazole·azoxystrobin SC， 560 g·L-1 azoxystrobin·chlorothalonil SC and 40% azoxystrobin·tebuconazole SC than other fungicides tested， which could be used as the preferred choices for the control of this disease.

Key words：Watermelon anthracnose; Colletotrichum incanum; Pathogen identification; Biological characteristics; Fungicides susceptibility

西瓜（Citrullus lanatus L.）是一年生蔓生草本植物[1]，其果肉味甜，能降温去暑;种子含油，可作消遣食品;果皮药用，有清热、利尿、降血压之效[2]，在我国各地均有栽培[3-4]。吉林省中西部地区常年种植西瓜，种植面积约4002 hm2，西瓜产业不仅是吉林省农村脱贫致富的重要产业之一，也在2018年被列为吉林省乡村振兴战略规划中的优势特色产业之一[5]。在生长过程中，西瓜会遭受到多种病原菌的危害[6-7]。其中，炭疽病是西瓜生产上最严重的病害之一，且有逐年加重的趋势，该病害会造成植株提早枯死，西瓜的产量和品质下降，使瓜农蒙受严重的损失[8-9]。目前，国内外学者普遍认为西瓜炭疽病多由Colletotrichum orbiculare引起[9-11]，2018年黄蔚等[12]从湘西民族职业技术学院科技园种植的感染炭疽病的西瓜病叶上分离出胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides。2018—2021年，笔者对吉林省西瓜主产区疑似感染西瓜炭疽病的病株进行采集，在分离和鉴定过程中发现了一些与C. orbiculare菌落形态不同的分离物，且在采集的样品中占有一定的比例。笔者进一步对所获得的分离物进行了致病性测定、形态学特征观察及系统发育分析，确认该病原菌为菜豆炭疽菌Colletotrichum incanum，并对该病原菌的生物学特性及药剂敏感性进行了相关研究。该研究为防控C. incanum引起的西瓜炭疽病提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 病害标本的采集与症状观察

2018年7月至2021年9月对吉林省及周边西瓜主产区（乾安县、长岭县、双辽市、内蒙古科尔沁左翼中旗）西瓜炭疽病的病样进行采集，调查并拍照记录病害的危害情况，部分样品用于病原菌的分离，其余部分样品制作腊叶标本保存于吉林农业大学植物病理教研室。

1.2 病原菌的分离与纯化

用无菌剪刀剪取样品病健交界处4 mm×4 mm组织块若干，置于75%乙醇溶液中浸泡消毒1 min后，用无菌水浸泡30 s，3次重复。风干2.5 h后，将组织块放置于PDA培养基上，在25 ℃恒温培养箱内进行培养。用无菌接种铲在菌落边缘铲起4 mm×4 mm菌块，继续培养。纯化后取菌丝块置于预先做好的PDA斜面培养基上，放置在4 ℃冰箱内保存备用[13]。

1.3 病原菌致病性测定

选择纯化后代表菌株Y 6-1，在PDA上培养20 d后，使用无菌水制作1×106个·mL-1的孢子悬浮液。在温室内采用常规喷雾法将孢子悬浮液接种到10株健康的西瓜（蜜红198，黑龙江全福种苗有限公司）幼苗上，对照植株喷无菌水。塑料袋保湿3 d，每天观察记录植株发病情况。采集发病部位进行病原菌分离，若分离到与原始接种物相同的分离物，则证明分离物是致病病原菌[14]。

1.4 病原菌的鉴定

1.4.1 病原菌的形态特征观察 肉眼观察病原菌在PDA培养基上的菌落形态、颜色、生长状况，用光学显微镜（Primo Star）观察病原菌产孢结构，用超景深显微镜（Axio Cam MRC5）观察分生孢子的形态特征，测量孢子大小（100个）并拍照，参照相关文献进行初步鉴定[15-17]。

1.4.2 病原菌的分子生物学鉴定 采用CTAB法从新鲜菌丝中提取基因组总DNA[18-19]。以提取出的总DNA为模板，进行特异性扩增，扩增反应体系（25.0 μL体系）：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，上游引物 1.0 μL，下游引物 1.0 μL;Taq酶 0.5 μL，DNA模板 1.0 μL，ddH2O 17.0 μL。选择引物ITS1/ITS4、ACT-512F/ACT-783R、CHS-354R/CHS-79F和GDF1/GDR1分别对核糖体内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）、肌动蛋白基因（actin gene， ACT）、几丁质合成酶A基因（chitin synthase A gene，CHS-1）和3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene，GAPDH）[20]进行PCR扩增，所有产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，随后委托上海生工公司完成测序。

将所得的序列上传至GenBank，并与GenBank核酸数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中的相关序列进行同源性比较。通过PAUP*（Phlogenetic Analsis Using Parsimon） v. 4.0b10（Swofford 2003）软件中的最大简约法（Maximum Parsimony，MP）构建多基因联合系统发育树对其分类地位进行确认。

1.5 病原菌生物学特性测定

1.5.1 不同培养基对病原菌菌丝生长及产孢的影响 10种培养基的制备方法如下：燕麦琼脂培养基（Oatmeal Agar，OA）：燕麦片20 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1000 mL;西瓜果皮煎汁琼脂培养基（Watermelon peel Decoction Agar，WDA）：西瓜皮100 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL;马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose Agar，PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1000 mL;水琼脂培养基（Water Agar，WA）：琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL;番茄燕麦琼脂培养基（Tomato Oat Agar，TOA）：番茄200 g，燕麦片30 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL;胡萝卜琼脂培养基（Carrot Agar，CA）：胡萝卜100 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL;西瓜果肉煎汁琼脂培养基（Watermelon pulp Decoction Agar，WPA）：西瓜果肉200 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL;马铃薯蔗糖琼脂培养基（Potato Sucrose Agar，PSA）：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL;玉米粉琼脂培养基（Cornmeal Agar，CMA）：玉米粉40 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL;马铃薯胡萝卜琼脂培养基（Potato Carrot Agar，PCA）马铃薯20 g，胡萝卜20 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1000 mL。