一株西瓜细菌性果斑病生防菌的筛选、鉴定及其培养基优化

摘要：为发掘对西瓜细菌性果斑病具有高效拮抗作用的生防菌株，采用初筛和复筛的方法，从种植西瓜的土壤中分离筛选出一株有较强抑制作用的菌株，并进行了盆栽试验。对其进行形态学、生理生化及分子生物学鉴定，同时通过单因素试验和正交试验对其培养基进行了优化。结果表明菌株HP-24对病原菌的抑制作用最强，抑菌圈直径为2.40 cm，经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。盆栽试验结果表明，菌株HP-24对细菌性果斑病的防效达76.72%。经过优化得到HP-24的最佳培养基组成为：1.0%的牛肉膏，1.3%的麸皮和0.7%的氯化钾。在最佳培养基条件下，发酵液中的活菌数达到1.17×10⁹CFU·mL^-1。研究结果为西瓜细菌性果斑病的生物防治提供了理论依据。

关键词：细菌性果斑病;生防菌;筛选;鉴定;培养基优化

中图分类号：S651文献标志码：A文章编号：1673-2871（2022）09-009-07

Screening and identification of a biocontrol strain against bacterial fruit blotch of watermelon and optimization of its culture medium

WANG Xueyan，MA Huan，YUE Dandan，ZHANG Zhilong，LI Guanjie，ZHANG Yingtao

（Institute ofBiology Co.，Ltd.，Henan Academy of Sciences，Zhengzhou 450008，Henan，China）

Abstract：In order to discover a biocontrol bacteria that has antagonistic effect on bacterial fruit blotch of watermelon，the soil from a watermelon field was used to isolate and screen with a combination method of primary screening and secondary screening. A strain HP-24 with strong inhibitory effect on the disease was obtained. The control effect of strain HP-24 on bacterial fruit blotch was tested by pot experiment. The strain was identified as Bacillus velezensis based on morphology，physiology，biochemistry and molecular biology. The culture medium was optimized by single factor test and orthogonal experiment. The results showed that the HP-24 strain had the strongest inhibitory effect on bacterial fruit blotch，and the diameter of the inhibition zone was 2.40 cm. The results of pot experiments showed that，the control effect of HP-24 strain on bacterial fruit blotch was 76.72%. The optimum culture medium compositions for HP-24 were beef extract 1.0%，bran 1.3%，potassium chloride 0.7%. The number of viable bacterium reached 1.17×10⁹ CFU·mL^-1 under the optimum medium condition. The strain should be useful for the biological control of bacterial fruit blotch of watermelon.

Key words：Bacterial fruit blotch;Biocontrol bacteria;Screening;Identification;Medium optimization

瓜类细菌性果斑病（bacterial fruit blotch，BFB）是危害葫芦科作物的重要病害之一，也是一类毁灭性细菌病害，其病原菌为西瓜噬酸菌（Acidovoraxcitrulli）。病原菌最初被命名为类产碱假单胞菌西瓜亚种（Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli），1992年Willems等将其更名为燕麦噬酸菌西瓜亚种（A. avenae subsp. citrulli），2008年更名为西瓜噬酸菌（A. citrulli）[1-4]。细菌性果斑病最早于1969年美国佛罗里达州被发现，随后在澳大利亚、日本、巴西、土耳其、希腊等国家均有发生的报道[5-6]。目前，该病害在我国的河南、内蒙古、山东、陕西、甘肃、新疆、海南、广西等地区均有报道，给西瓜、甜瓜产业带来了严重威胁，造成了巨大的经济损失[7]。

瓜类细菌性果斑病属于种传病害，其病原菌可以在种子中长期存活，具有较强的抗逆能力，给防治带来了极大的困难[8-9]。目前，细菌性果斑病的防治主要集中在种子检疫、抗病品种选育、化学防治和生物防治等方面[10]。在种子生产上应强化种子的消毒处理，确保种子无菌，应杜绝带菌种子进口。另外，使用抗病品种是防治细菌性果斑病的有效措施，但迄今为止，尚未发现对该病完全免疫或高抗的品种。细菌性果斑病的化学防治通常以药剂防治为主，但实际应用中很难做到科学合理地使用杀菌剂，化学药剂的大量使用不仅会造成环境污染，导致农药残留，而且会使病原菌逐渐产生抗药性[11-12]与化学防治相比，生物防治具有安全、无污染、对环境友好的优点，是绿色植保的重要内容，日益受到人们的青睐。因此，生物防治已成为植物病害防治的重要内容之一。目前，针对西瓜细菌性果斑病，国内外已报道的生防菌株有荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens（A506）、非致病菌Aavenae subsp. avenae（AAA99-2）、荧光假单胞菌（P fuorescens）工程菌株（染色体整合了2，4-二乙酰基间苯三酚）、酵母菌（Pichia anomala），以及芽孢杆菌如解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等「13-17]。笔者通过对西瓜根际土壤细菌的分离筛选，得到了一株对细菌性果斑病病原菌具有较好拮抗效果的生防菌株HP-24，通过形态学、生理生化试验和分子生物学手段对其进行了鉴定，并对其发酵培养基进行了优化，以期为生防菌剂的开发利用提供菌株资源，为细菌性果斑病的防治提供技术支撑。

1材料与方法

1.1材料

土样采自河南省周口市太康县西瓜种植田。病原菌（燕麦噬酸菌西瓜亚种）来自中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为ACCC05732。培养基为营养肉汤培养基（NB培养基），培养温度为28 ℃。

盆栽试验西瓜品种为早佳8424，种子购自北京万丰农研科技有限公司。NB培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1000 mL，pH 值7.3 ;NA培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1000 mL，琼脂18.0 g，pH 值7.3 ;KB 培养基：蛋白胨20.0 g，甘油10 mL，K₂HPO₄1.5 g，MgSO₄7mL，H₂O 1.5 g，琼脂18.0 g，蒸馏水1000 mL，pH 值7.2。

1.2方法

1.2.1土样采集和生防菌初筛根据种植西瓜品种不同，从瓜田植株根附近分别采集土壤样品（采集时间为2020年8月9日），西瓜品种分别为早佳8424、黑美人和美都。2020年8月在实验室各取土样10 g加入到装有90 mL ddH₂O和10个玻璃珠（已灭菌）的三角瓶中，180 r·min^-1振荡30 min，充分打散土样，制成土壤悬浮液，用10倍梯度稀释法依次稀释至10^-7，再分别从稀释倍数为10^-5、10^-6、10^-7的稀释液中取100 μL涂布干NA平板上，每个稀释浓度3次重复，30℃恒温培养24 h后挑取具有明显差异的菌落，经平板划线纯化，编号后保存备用。

1.2.2生防菌的复筛将病原菌在NB培养基中活化后制成浓度为10⁸ CFU·mL^-1的菌悬液，吸取2 mL 于KB平板上，轻轻晃动平板，使菌液布满整个平板，随后将多余的菌液吸出，于生物安全柜的无菌环境中风干培养基平板表面的菌液。将筛选出的生防菌均匀点种到平板上，每个菌株重复点接3次，28 ℃培养48 h，筛选出具有抑菌圈的菌株。将有拮抗作用的菌株进行多次继代培养，选择拮抗作用稳定且效果最好的菌株。

1.2.3盆栽防效的测定采用盆栽西瓜幼苗喷雾法测定菌株HP-24的防治效果。选取健康、饱满的西瓜种子进行催芽处理，然后采用常规方法播种于盆钵内（口径13 cm×18 cm），试验在河南省科学院生物研究所人工环境气候箱中进行。待西瓜幼苗长出2～3片真叶后（2022年5月16日），将活化好的菌液浓度为10⁸ CFU·mL^-1的HP-24菌悬液喷施到真叶上，晾干后采用喷雾法接种菌液浓度为10⁸ CFU·mL^-1的西瓜细菌性果斑病病原菌，叶片正、反两面要均匀喷施。30 ℃保湿24 h后进行常规管理，以喷KB液体培养基的处理为对照，观察发病情况。每个处理3盆重复，每盆5棵苗。7 d后，观察西瓜幼苗的发病情况，计算病叶率、病情指数及防治效果。

1.2.4生防菌株的鉴定形态学观察及生理生化鉴定：将拮抗作用最好的菌株HP-24接种于NA 培养基上，30 ℃培养24 h后，观察菌落和菌体形态，并参照《常见细菌鉴定手册》[18]进行生理生化鉴定试验。

16S rRNA基因序列分析：提取菌株的基因组DNA，采用通用引物27F/1492R进行PCR扩增，引物为27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，PCR扩增体系为25.0 μL，包括ddH₂O 18.0 μL，10×buffer2.5 μL，dNTP 1.0μL，正向和反向引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL。PCR反应条件为95 ℃4 min，95 ℃1 min，52 ℃30 s，72 ℃2 min，30 个循环;72 ℃10 min。PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后测序，测序结果在GenBank数据库中进行BLAST相似性比对。

系统发育树构建：测序获得的16SrRNA部分序列经BLAST同源比对后，从GenBank中获取同源性较高的相邻的种、属的序列，同时查找相邻种、属中模式种的16S rRNA序列，使用MEGA 6软件进行系统发育树构建。

1.2.5有菌与无菌发酵液的抑菌试验将菌株HP-24接种到100 mL NB液体培养基中，30 ℃180 r·min^-1培养24 h，发酵液于4 ℃10 000 r·min^-1离心20 min，再用孔径为0.22 μm的细菌过滤器过滤上清液，得到无菌发酵液。在涂布病原菌液的KB平板上用无菌打孔器打孔，向孔内加入带菌发酵液和无菌发酵液各50 μL及离心得到的菌体，于30 ℃培养48 h，每个处理3次重复，观察抑菌效果。

1.2.6不同浓度发酵液的抑菌试验将菌株HP-24接种到100 mL NB液体培养基中，30 ℃180r·min^-1培养24 h后，用无菌的NB培养基分别稀释2、4、8倍。在涂好病原菌液的KB平板上用无菌打孔器打孔，分别向孔内加入不同稀释倍数的发酵液各50 μL，于30 ℃培养48 h，每个处理3次重复，观察抑菌效果。

1.2.7发酵培养基的优化碳源的优化：于250 mL三角瓶中配置100 mL培养基，其中蛋白胨1.0 g、氯化钠0.5 g，分别选取牛肉膏、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉作为碳源，碳源添加量为0.3 g，调节pH值为7.3，接入种子液2 mL，30 ℃180 r·min^-1培养24 h，每个处理3次重复，根据活菌数确定最佳碳源。配置不同浓度的碳源培养基，其中蛋白胨1.0 g、氯化钠0.5 g，碳源为经优化确定的最佳碳源，质量分数分别为0.3%、0.5%、0.7%、0.9%和1.1%，调节pH值为7.3，接种量为2%，30 ℃180r·min^-1培养24 h，每个处理3次重复，统计活菌数并确定最适碳源浓度。