西瓜噬酸菌磷酸盐特异性转运系统pstS基因功能分析

摘    要：以西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli）Aac5菌株为研究对象，构建了pstS基因的缺失突变菌株和互补菌株，进行了致病能力及生物学表型的测定，并通过荧光定量PCR分析了pstS缺失对西瓜噬酸菌致病相关基因和磷酸盐特异性转运系统相关基因表达量的影响。此外，测定了西瓜噬酸菌的PstS蛋白在大肠杆菌中表达时对Pi的结合能力。结果表明，pstS的缺失，降低了西瓜噬酸菌的致病能力、运动能力、体外生长能力和生物膜形成能力，但不影响西瓜噬酸菌诱导烟草产生过敏性坏死反应的能力。pstS缺失后III型分泌系统基因hrpG、鞭毛基因fliC、毒力相关基因virB、趋化性相关基因cheA、群体感应基因luxR的相对表达量显著上调，III型分泌系统基因hrpX的相对表达量下调。磷酸盐特异性转运系统相关基因Aave_2627、Aave_2628、Aave_2629、Aave_2631和Aave_2632表达量均上调。经PstS对Pi的结合能力试验，证明在大肠杆菌中异源表达的PstS蛋白具有Pi结合能力。研究表明，pstS在西瓜噬酸菌致病能力和Pi转运吸收过程中的Pi结合环节起到重要作用。

关键词：西瓜噬酸菌;磷酸盐特异性转运系统;pstS

中图分类号：S651 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2022）10-016-10

Functional analysis of the pstS gene of the phosphate specific transport system of Acidovorax citrulli

CAI Fuyu1， FEI Nuoya1，2， QIAO Pei1， GUAN Wei1， YANG Yuwen1， YE Yunfeng3， ZHAO Tingchang1

（1.State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests/Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China; 2.Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， Liaoning， China; 3.Horticultural Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， Guangxi， China）

Abstract： In this study， Acidovorax citrulli Aac5 strain was used to construct pstS mutant strain and its complementary strain. The pathogenicities and biological phenotypes of different strains were determined， the effect of pstS deletion on the expression of the pathogenicity-related genes and the phosphate specific transport system-related genes of A. citrulli was analyzed by qRT-PCR and the ability of binding Pi when PstS protrin heterologously expressed in E.coli. The results showed that the absence of pstS reduced the pathogenicity， swimming motility ，biofilm formation ability and growth ability of A. citrulli， and did not affect the ability of inducing hypersensitive reaction in non-host plants. The relative expression of type III secretion system gene hrpG， flagellar gene fliC， virulence-related gene virB， chemotaxis-related gene cheA， and quorum sensing gene luxR were up-regulated， and the expression of type III secretion system gene hrpX was down-regulated. The relative expression levels of phosphate specific transport system related genes Aave_2627， Aave_2628， Aave_2629， Aave_2631 and Aave_2632 were all up-regulated. The Pi-binding ability test of PstS proved that the PstS protein heterologously expressed in E. coli has Pi-binding ability. In conclusion， pstS plays an important role in virulence of A. citrulli and the Pi binding link in the process of Pi transport and absorption.

Key words： Acidovorax citrulli; Phosphate specific transport system; PstS

瓜类细菌性果斑病（bacterial fruit blotch，BFB）是葫芦科作物上的检疫性种传病害，于20世纪90年代在我国首次被发现和报道，破坏性强，往往给瓜类生产造成严重损失[1]。BFB的病原为西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli），是一种革兰氏阴性细菌[2]。已知III型分泌系统（type III secretion system，T3SS）在西瓜噬酸菌的致病过程中起关键作用[3-6]。近年来的研究也表明，西瓜噬酸菌的鞭毛、生物膜、群体感应和趋化性等也能在一定程度上影响西瓜噬酸菌的致病能力[7-10]。

革兰氏阴性菌中存在多种转运系统来完成对物质的吸收和利用，比如从外界摄取亚铁离子的Feo转运系统、负责胞内脂蛋白转运的Lol系统、转运大分子营养物的TonB复合物等[11-13]。磷酸盐的吸收和利用主要由磷酸盐特异性转运系统（phosphate specific transport，Pst）和磷酸盐转运系统（phosphate inorganic transport，Pit）完成[14-15]。Pst属于磷酸盐调节子（Pho regulon），一般由PstS、PstC、PstB、PstA和PhoU 5个蛋白组成[16]。磷酸盐调节子的主要功能是控制磷（Pi）稳态，但有研究发现该系统在病原菌的致病过程中也发挥着作用[17-19]。在迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）中，Pst的突变会影响其在寄主上的毒力，并且T3SS的跨膜蛋白和其他毒力相关蛋白的分泌也会受到影响[20]。然而，目前Pst通过何种机制影响细菌的致病性尚未明确。PstS是Pst中的Pi结合蛋白，负责结合周质空间中的Pi。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中pstS基因缺失后，细菌一直处于Pi饥饿状态，且生物膜形成能力显著降低，而在致金色假单胞菌（Pseudomonas aureofaciens）147-2菌株中Pst负调节生物膜的形成[21-22]。假单胞菌（Pseudomonas sp.）wj1中PstS蛋白在大肠杆菌中过量表达后，使得重组大肠杆菌的无机磷酸盐吸收率显著提高，表明PstS蛋白具有结合Pi的能力，但在菌浓度不变的情况下，周质空间的Pi浓度增加会抑制PstS蛋白对Pi的结合[23]。

为明确pstS在西瓜噬酸菌中的功能，笔者构建了西瓜噬酸菌pstS基因的缺失突变菌株和互补菌株，通过对致病性、生物膜形成能力等致病相关表型及转录调控能力的测定，初步分析pstS在西瓜噬酸菌致病过程中发挥的作用，为解析西瓜噬酸菌的致病调控网络提供分子依据。同时通过测定在大肠杆菌中表达西瓜噬酸菌的PstS蛋白时该蛋白与Pi的结合能力，初步分析pstS是否在西瓜噬酸菌对磷酸盐吸收的Pi结合环节发挥作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株、质粒及引物 试验所用菌株和质粒见表1，引物序列见表2。

1.1.2 培养基及培养条件 （1）金氏B（King’s B，KB）培养基：胰蛋白胨15 g，K2HPO4 1.5 g，MgSO4·7 H2O 1.5 g，丙三醇15 mL，pH=7.0，加入ddH2O定容至1 L;（2）溶菌肉汤（lysogeny broth，LB）培养基：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母粉5 g，pH=7.0，加入ddH2O定容至1 L;（3）0.3%半固体培养基：细菌专用运动性蛋白胨0.3 g，酵母提取物0.3 g，琼脂粉0.3 g，pH=0.7，加入ddH2O定容至1 L;（4）M9蔗糖培养：Na2HPO4·12H2O 75.6 g，KH2PO4 15 g，NH4Cl 5 g，NaCl 2.5 g，20% C6H5Na3O7 10 mL，1 mol·L-1 MgSO4 1 mL，蔗糖100 g，pH=7.0，加入ddH2O定容至1 L。配置固体培养基（除0.3%半固体培养基外）则在以上配方基础上再添加1.5%的琼脂。以上培养基于121 ℃高压灭菌（蔗糖培养基110 ℃高压灭菌）20 min。试验所用抗生素终质量浓度分别为：氨苄青霉素（Ampicillin， Amp）100 μg·mL-1;卡那霉素（Kanamycin， Km）50 μg·mL-1;氯霉素（Chloraphenical， Cm）25 μg·mL-1。试验中，西瓜噬酸菌及其衍生菌株于KB培养基28 ℃培养;大肠杆菌及其衍生菌株于LB培养基37 ℃培养。

1.1.3 试剂及仪器 试验主要试剂有：KOD高保真酶（Toyobo）、凝胶回收试剂盒（Axygen）、DNA Marker（北京博迈德基因技术有限公司）、蛋白预制胶（北京全式金生物技术有限公司）等，分别购自国药集团试剂有限公司和西格玛公司。试验所用引物均由北京六合华大基因科技有限公司合成。本试验所用仪器有：基础电泳仪和小垂直板电泳槽（BIO-RAD），低温离心机（Eppendorf）、PCR仪（BIO-RAD）、智能人工气候培养箱（宁波江南仪器厂）、分光光度计（Nano VuePlus）等。

1.2 试验方法

1.2.1 西瓜噬酸菌PstS蛋白结构域预测分析 根据NCBI数据库的氨基酸序列（Aave_2626）使用SMART网站在线预测PstS蛋白结构域。

1.2.2 突变菌株ΔpstS及互补菌株ΔpstScomp的构建和筛选 试验于2020年6月在中国农业科学院植物保护研究所进行。利用Primer 5.0软件设计克隆Aac5菌株pstS基因的上下游片段引物pstSL-F/R、pstSR-F/R（表2），使用DNAMAN 5.2.2将Aac5的pstS基因序列与KEGG数据库中AAC00-1菌株的pstS基因进行比对，相似性为100%。通过overlapping PCR技术融合pstS基因上下游片段，将融合片段连接到自杀性质粒pk18mobsacB中构建重组质粒pk18-pstS。利用同源重组双交换原理，筛选突变菌株，三亲杂交将重组质粒pk18-pstS导入野生型Aac5菌株中。在含有抗生素加10%蔗糖的M9平板上筛选得到突变株。使用西瓜噬酸菌特异性引物WFB1/WFB2以及目的基因的特异性引物pstS-F/R进行基因的PCR扩增和测序验证。