茭白叶斑病病原鉴定及其对5种杀菌剂的敏感性测定

摘    要：为鉴定茭白叶斑病病原，筛选可用于病害防治的化学药剂，对来自扬州市邗江区的茭白病样进行组织分离和分离物致病性测定，形态和分子生物学鉴定及杀菌剂敏感性测定。结果表明，分离获得的2个菌株JBYB1和ZLC1为稻平脐蠕孢Bipolaris oryzae和竹节蓼弯孢Curvularia muehlenbeckiae，分别引起茭白胡麻叶斑病和茭白弯孢叶斑病。JBYB1和ZLC1最适生长条件为：在25～28 ℃或25～30 ℃，pH值6～7，以葡萄糖或蔗糖为碳源、以硝态氮为氮源的PDA培养基，光照或光暗交替培养。5种杀菌剂（己唑醇、吡唑醚菌酯、咪鲜胺、氟环唑和咯菌腈）对JBYB1和ZLC1均有较好的抑制作用，其中咯菌腈毒力最强。综上所述，分离获得的茭白叶斑病的病菌为B. oryzae和C. muehlenbeckiae，供试的5种杀菌剂均可用于茭白叶斑病的田间防治。

关键词：叶斑病;茭白;病原鉴定;毒力测定

中图分类号：S645.2 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2022）10-034-08

Pathogen identification of cane shoots leaf spot and determination of its sensitivity to five fungicides

JIANG Dongyang1， CHEN Xijun1， CHEN Yinfeng2， CHEN Chen1， ZHANG Zhiping1， WEI Lihui3

（1. College of Plant Protection， Yangzhou University， Yangzhou 225009， Jiangsu， China; 2.Hanjiang District Agricultural Technology Promotion Center， Yangzhou 225100， Jiangsu， China; 3. Institute of Plant Protection， Jiangsu Academy of Agricultural Science， Nanjing 210014， Jiangsu， China）

Abstract： In order to identify the pathogens of cane shoots（Ziania latifolia）leaf spot and choose the fungicides to control these diseases， tissue isolation of diseased cane shoots plants from Hanjiang district of Yangzhou city and pathogenicity determination， morphologic observation， sequences of ITS and conserved genes blasting， and toxicity of fungicides determination of the isolates were performed. Results showed that two strains， isolated from disease plants and named JBYB1 and ZLC1， were identified as Bipolaris oryzae and Curvularia muehlenbeckiae， which cause Bipolaris leaf spot and Curvularia leaf spot of cane shoots， respectively. Analysis of the growth conditions showed that the optimum growth conditions of them include the temperature from 25 to 28 ℃ of JBYB1 or from 25 to 30 ℃ of ZLC1， pH from 6 to 7， and pathogens cultured in darkness or alternating darkness with PDA including dextrose or sucrose used as carbon source and nitrate nitrogen used as nitrogen source. Sensitivity assays indicated that fungicides included hexaconazole， pyraclostrobin， prochloraz， epoxiconazole and fludioxonil all had higher virulence to the two fungal isolates. Among these fungicides， fludioxonil had the strongest virulence to the two pathogens. In conclusion， pathogens isolated from diseased leaves of cane shoots leaf spot were B. oryzae and C. muehlenbeckiae， and all the fungicides tested can be used to control the disease.

Key words： Zizania latifolia; Brown spot; Pathogen identification; Virulence detection

茭白（Zizania latifolia）又叫作茭瓜、茭笋、高笋、菰首，是我国的一种重要水生蔬菜，主要种植于长江中下游及其以南省份，包括江苏、浙江、安徽、福建、湖北、湖南和广东等，已有2000多年的栽培历史[1-2]。近年来，随着人们对高品质蔬菜的需求越来越大，茭白的种植面积逐年增长，并不断有新品种被推出[3-4]。在有些地区，通过人工湿地中的野茭白可对排入的酸性重金属废水进行净化处理[5]。在茭白栽培过程中，可能受到多种病害的侵袭，如茭白胡麻叶斑病（Bipolaris oryzae）、茭白锈病（Uromyces coronatus）、茭白纹枯病（Rhizoctonia solani）、茭白褐色菌核病（Sclerotium oryzae-sativa）和茭白瘟病（Pyricularia oryzae）等[6-8]。与其他蔬菜相比，虽然茭白的种植面积近年来有所增加，但仍属于小众蔬菜，有关茭白特别是茭白病害研究的报道并不多，目前已报道的茭白病害仅10余种[9-11]。且已有的多数研究只对茭白病害进行简单的症状描述，从病害症状、病原种类与生物学特性、病害发生规律、影响病害发生因素以及病害防治等方面进行系统研究的报道较少。因此，进一步分离鉴定田间引起茭白病害的病原物，对茭白病害的诊断与防控具有重要意义。

关于茭白病害防控的药剂，目前仅有井冈霉素和噻呋酰胺被登记用于防治茭白纹枯病，丙环唑和咪鲜胺登记用于防治茭白胡麻叶斑病[12]。杨绍丽等[13]测定了苯醚甲环唑、丙环唑、甲基硫菌灵和福美双等8种药剂对茭白胡麻叶斑病（B.oryzae）的室内毒力，发现有3种药剂的EC50值小于0.1 μg·mL-1，具有很好的应用潜力。在茭白分蘖盛期用24%噻呋酰胺300～450 mL·hm-2喷施，药后20 d对茭白纹枯病的防效在82.64%～85.44%[14]。此外，腈菌唑、稻瘟灵、咪鲜胺、己唑醇、嘧菌酯等也常被用于茭白相关病害的防控[13]。但由于登记药剂较少，生产中农民多凭经验甚至任意用药，不仅造成田间防效差，而且加重对环境的污染，食品安全也得不到有效保证。翁丽青等[15]测定了7种药剂对茭白胡麻叶斑病的防效，12.5%烯唑醇可湿性粉剂2500倍液施用2次后，7 d和14 d防效最高也仅为64.0%和55.67%，其他药剂效果更差。因此，笔者在分离鉴定茭白叶斑病病原的基础上，测定了5种常用杀菌剂对叶斑病菌的毒力，以期为生产上茭白叶斑病的防控提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试品种：浙茭7号。供试仪器：PCR仪[德国艾本德（Eppendorf）股份公司]、凝胶成像系统、电泳仪[伯乐（BIO-RAD）生物科技有限公司]。供试试剂：DNA提取试剂（北京索来宝科技公司）、ExTaq酶[大连宝生物（TaKaRa）公司]、T4 DNA连接酶、pMD 19-T质粒、大肠杆菌DH5 α感受态[赛默飞世尔（Thermo Scientific）科技公司]。供试农药：97%氟环唑原药、95%己唑醇原药（江苏丰登作物保护有限公司），98%吡唑醚菌酯原药（山东省联合农药工业有限公司），97%咪鲜胺原药、97%咯菌腈原药（江苏云帆化工有限公司）。

1.2 菌株分离

茭白叶斑病病样于2019年7月采自江苏省扬州市邗江区丁沟镇。取田间采集的新鲜发病叶片，于室内用去离子水冲洗表面后，取病健交界处组织于10%次氯酸钠溶液中消毒20～30 s，无菌水漂洗3次后置于无菌滤纸上，吸干水分后将病组织置于含有乳酸[每1000 mL培养基加12 mL 25%乳酸（φ，下同）]的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA，200 g马铃薯，17 g葡萄糖，20 g琼脂粉，1000 mL水）上，于25 ℃恒温培养箱中黑暗培养。待组织边缘长出菌落，用挑针取一小块回接至PDA平板，待菌落长满平板后，挑取菌丝于显微镜下观察，镜检是否只有一种菌丝和孢子。若是，则表明获得纯培养菌株，并将该菌株移至PDA斜面，待菌落长满斜面后4 ℃冰箱保存，备用。

1.3 病原菌致病性测定

通过离体叶片接种法测定病原菌致病性。2020年5月，于扬州市邗江区瓜洲蔬菜基地取健康茭白叶片，95%酒精表面消毒后用无菌水冲洗干净，然后平铺于垫有3层棉纱布（完全浸润）的白瓷盘上。将50 μL 1.0×104个孢子·mL-1孢子液滴在茭白叶片表面，以不接菌处理作对照，每个处理5个叶片，3次重复。用保鲜膜密封瓷盘，置于扬州大学作物病害综合防控实验室25 ℃恒温光照箱中，12 h/12 h（光/暗）交替培养，观察病斑情况。

1.4 病原菌形态学鉴定

将分离纯化后得到的菌株接种到PDA平板中央，25 ℃黑暗条件下培养5 d，肉眼观察菌落形态特征，十字交叉法测量菌落直径。用挑针挑取菌落边缘菌丝制成玻片，在显微镜下观察菌丝形态。将从菌落边缘挑取菌块接种至燕麦培养基上，25 ℃黑暗条件下培养30 d，用挑针挑取病原菌孢子制成水浸片，在显微镜下观察分生孢子和分生孢子梗形态，测量孢子大小，共计100个孢子。

1.5 病原菌分子生物学鉴定

收集马铃薯葡萄糖培养液（PDB）中生长36 h的菌丝，50 ℃烘箱中干燥48 h后，按北京索来宝科技公司真菌基因组DNA提取试剂盒操作步骤提取菌株DNA，以真菌ITS区通用扩增引物ITS4/ITS5（ITS4：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG;ITS5：TCCTCCGCTTATTGATATGC）对菌株DNA进行PCR扩增。扩增体系为：模板2 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，10×Taq Buffer 2 μL，dNTP Mixture 0.5 μL，ITS4/ITS5各1 μL，ddH2O 13 μL，反应体系总计20 μL。扩增程序为：94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物经回收后，连接至大肠杆菌DH5α，并送南京擎科生物技术公司进行测序。所得序列在GenBank中进行序列比对后，利用MEGA7.0软件构建系统进化树。