甘蓝型油菜油脂合成相关基因的动态表达分析

摘要：甘蓝型油菜（Brassica mvus L.）是我国重要的油料作物之一，提高甘蓝型油菜种子的含油量是育种工作的目 标。利用转录组测序技术（RNA-seq）对甘蓝型油菜"中9”不同发育时期的种子样品进行表达分析，重点关注 进行油脂合成的相关基因的动态表达分析，明确这些基因在种子发育不同时期的表达情况，为进一步阐释油 脂合成相关基因代谢调控机理提供素材。

关键词：甘蓝型油菜;种子发育;油脂合成;转录组

文章编号：1005-2690（2022）12-0001-03 中国图书分类号：S565 文献标志码：B

甘蓝型油菜（下称“油菜”）是我国重要的油料作物 之一，在世界上是仅次于大豆的油料作物残油菜在为 人类提供食用油的同时，也可以作为动物饲料、生物燃 料等为人类生产生活提供丰富的物质材料，因此油菜 的种植与研究对人类具有重要意义㈣。种子含油量是油 菜最重要的品质性状之一，对油菜种子含油量进行遗 传改良，可以满足人们的食用需求。不同油菜种子材料 之间的含油量差别明显叫提高油菜种子含油量，一直 以来都是油菜育种工作者的研究重点和热点。

目前，在油菜种和油量的遗传分析和QTL定位四、 调控油脂合成关键基因的功能研究、油脂合成相关基 因的表达和代谢调控等方面取得了丰硕的研究成果。 虽然油脂合成的代谢通路已经研究透彻，但影响油菜 种子含油量和调控油脂合成的因素多种多样旳，阐释 这些因素对油脂合成调控的机理，有助于加快油菜高 含油量分子育种的进程。在种子发育的过程中，许多基 因在不同阶段所发挥的作用也不尽相同，因此，分析种 子发育过程中油脂合成相关基因的动态表达水平以及 在蛋白质组水平上的代谢调控，有利于系统地解析油 脂的合成过程，进一步了解含油量的决定因子。

本试验利用转录组测序技术，重点分析油菜种子 不同发育时期油脂合成相关基因的动态表达水平，有 利于加深对油菜油脂合成过程的了解，为后期高含油 量油菜品种的选育以及转录组测序技术在油菜分子遗 传上的有效运用提供有力帮助。

1材料与方法

1.1材料

甘蓝型油菜“中9”为研究对象，取发育中（授粉后15 d）和成熟期种子作为试验材料，每个材料3次重复。

1.2 RNA提取、文库构建和高通量测序

剥去种皮，只保留种子，用于RNA提取。种子剥离 后放入液氮冷冻，于-80龙保存。利用总RNA提取试 剂盒提取RNA，并于70%乙醇中-20乞长期保存。建 库和测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

1.3差异基因分析

测序的下机数据使用FastQC进行质控，符合分析 标准的测序数据转而使用Trimmomatic软件进行过滤， 以去除低质量的Reads （Trimmomatic软件参数如下： LEADINGS TRAILING？ SLIDINGWINDOW4：15MINLEN： 30）o使用STAR软件，将过滤后的reads比对到油菜参 考基因组序列上。接着，使用RSEM软件对各个样本进 行转录本定量。使用定量分析的结果生成矩阵，构造 DESeq2的输入文件，进行两个组合之间的差异表达分 析。PW0.05且Ilog2foldchangel>l的基因被认为存在 差异表达。

1.4GO分析通过基迪奥生信分析平台（https ：//www.omicshare. com/tools/）的GO富集分析模块实现差异表达基因的 GO富集分析（PvO.05）。

1.5KEGG 分析使用KOBAS 3.0软件分析KEGG通路中差异表达 基因的统计富集，以P调整值作为阈值。

2结果与分析

2.1差异表达基因分析

对油菜种子成熟期和发育期表达基因进行差异表 达基因的筛选，共筛选得到油菜种子成熟期相对于发育期差异表达基因总数为36294 个，其中上调转录基 因数量为 13423 个，下调转录基因数量为 22871 个 。

2.2 差异表达基因GO 注释分析

通过对成熟期种子表达上调的基因进行 GO 注 释（如图 1 所示）可知，生物过程中富集到基因条目数 量最多的依次为代谢过程（GO：0008152，3435 个 基 因）、细胞过程（GO：0009987，3250 个基因）、单有机体 过程（GO：0044699，2091 个基因）等。细胞组件富集到基 因条目数量最多的依次为细胞（GO：0005623，1827 个 基因）、细胞部分（GO：0044464，1827 个基因）等。分子功能富集到基因条目数量最多的依次为绑定（GO：0005488，6286 个基因）、催化活性（G0：0003824，3228 个基因）等。

通过对成熟期种子表达下调的基因进行 GO 注 释（如图2 所示）可知，生物过程中富集到基因条目数 量最多的依次为代谢过程（GO：0008152，6262 个基因）、 细胞过程（GO：0009987，5429 个基因）、单有机体过程（GO： 0044699，4589 个基因）等。细胞组件富集到基因条 目数量最多的依次为细胞（GO：0005623，2735 个基因）、 细胞部分（GO：0044464，2735 个基因）、膜（GO：0016020， 2294 个基因）等。分子功能富集到基因条目数量最多的依次为绑定（G0：0005488，8 925个基因）、催化活 性（G0：0003824，6 661 个基因）等。

差异表达基因GO注释分析结果表明，成熟期的 油菜种子和发育期的油菜种子中表达差异基因在生物 过程中都富集于代谢过程，在细胞组件一类中富集于 细胞、细胞部分、膜和细胞器，在分子功能一类中富集 于绑定。乙酰辅酶A梭化酶是脂肪酸合成过程中的关 键酶，其主要存在于质体和胞质中，脂肪酸的合成是在 叶绿体中完成。由此得以说明，油菜种子油脂合成和植 物质体的代谢过程有关。

2.3差异表达基因KEGG分析

根据KEGG数据库，对差异上调表达基因进行功 能分类和Pathway注释，如图3所示，其中1 365个基 因注释到115条代谢途径中，200个基因富集到代谢 通路途径，注释基因最多;156个基因富集到核糖体途 径;104个基因富集到次生代谢物生物合成途径等。富 集比例最高的是内酰胺类抗生素途径，富集比例为 0.15，然后依次是0.14的咖啡因代谢途径、0.125的酮 体合成和降解途径等。

对差异下调表达基因进行功能分类和Pathway注 释，如图4所示，其中1 653个基因注释到115条代谢 途径中，337个基因富集到代谢通路途径，注释基因最 多;184个基因富集到次生代谢物生物合成途径等。富集比例最高的是光合作用-天线蛋白通路途径和次级 代谢物的生物合成通路途径，富集比例为0.295，然后 是富集比例为0.237的光合作用途径等。

差异表达基因的通路分析表明，甘蓝型油菜成熟 期种子中差异表达基因上调与代谢通路、核糖体途径 等相关，上调基因富集于内酰胺类抗生素途径、咖啡因 代谢途径、酮体合成和降解途径;差异基因下调则与代 谢通路、次生代谢等相关，下调基因富集于光合作用- 天线蛋白通路途径和次级代谢物的生物合成通路途 径、光合作用途径。相关研究表明，作为脂肪酸合成首 步反应的关键因子之一的ACCase，其活性受光限制， 并且在油菜光合作用时，一些从叶绿体中产生的ATP 和NADPH会被用在脂肪酸的合成中。

2.4油脂代谢相关基因动态表达分析

通过对差异表达基因的KEGG富集分析发现，上 调基因中参与脂肪酸降解、不饱和脂肪酸的生物合成、 脂肪酸代谢、脂肪酸延伸的基因分别有11个、4个、7个 和2个，下调基因中参与脂肪酸生物合成、脂肪酸降 解、不饱和脂肪酸的生物合成、脂肪酸代谢、脂肪酸延 伸的基因分别有18个、2个、6个、18个和4个，见表1。 说明在油菜种子不同发育时期，参与脂肪酸生物合成、 脂肪酸降解、不饱和脂肪酸的生物合成、脂肪酸代谢、 脂肪酸延伸等与油脂代谢相关的基因表达水平发生了 明显变化，共同调控油脂的合成与代谢。

3结束语

油菜作为我国的主要油料作物，在我国农业生产和生活中占据着非常重要的地位。随着国民经济的飞速发展和市场的需求，提高油菜品种的油脂含量成为了育种者的主要目标之一。目前，国际上有许多关于油菜油脂合成相关基因的研究报道，但对这些基因如何调控油菜油脂合成等相关问题还有待科研工作者的后续研究。

本试验通过转录组测序技术，对甘蓝型油菜“中9”不同发育时期的种子样品的转录组数据进行分析，重点关注甘蓝型油菜种子不同发育时期与油脂合成有关的基因表达变化，为研究油脂合成相关基因代谢调控机理提供理论基础，同时也为后期选育高含油量油菜品种和RNA-seq在分子生物学上的有效运用提供了支持。

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