番茄中Ty-1抗性机制研究

摘    要：Ty-1抗性基因是防治番茄黄叶卷曲（TYLCV）双病毒应用最广泛的基因之一。研究表明，Ty-1通过增强转录基因沉默（TGS）来增强抗性，并对双组分番茄褶皱病毒（ToSRV）具有保护作用。在Ty-1番茄植株中使用病毒诱导基因沉默（TRV2-180和TRV2-190），Ty-1抗性基因被证明可以防止单体叶蝉传播的甜菜卷曲顶病毒（BCTV）的感染。

关键词：抗性；基因沉默；番茄黄叶卷曲病

文章编号：1005-2690（2022）16-0005-04       中国图书分类号：S641.2       文献标志码：B

1 Ty-1特性

番茄黄叶卷曲病毒（TYLCV）是世界上最具毁灭性的植物病毒之一。为了抵御这种病毒，一些抗性基因被用于育种中。植物基因组中存在的抗病基因通过产生R蛋白，为植物抵抗病原体提供抗病能力。在这些基因中，Ty-1抗性基因的应用最为广泛，许多商业杂交品种都携带Ty-1[1]。Ty-1最早在1969年智利南部发现，在最初的大规模重组筛选中首次提出了Ty-1的简单图谱，如今已经鉴定并克隆了Ty-1抗性基因。虽然Ty-1不编码经典的NBS-LRR基因，也不产生涉及超敏反应（HR），但Ty-1影响病毒的复制或移动，含有该基因的植物表现出更多的耐受性。

RNA沉默是一种基于序列同源性的基因调控机制，保留在真核生物中，不仅与调节基因表达有关，还抵御转座子等寄生遗传因素，并控制转基因和病毒[2]。RNA沉默，也称为RNA干扰（RNAi），通常被认为是植物和昆虫中的一种抗病毒防御机制，也被证明在哺乳动物中起到抗病毒作用。在RNAi的机理过程中有4个关键部分：长双链RNA（dsRNA）、21-26 nt短干扰RNA小链（siRNA）、内核糖核酸酶（Dicer）和RNA诱导沉默复合物（RISC）（见图1）。

在植物中，RNA病毒通过转录后基因沉默（PTGS）作为靶标，而像双子病毒的DNA病毒则通过转录后基因沉默（TGS）作为靶标[3]。PTGS和TGS的抗性策略不同（见图2），TGS通过细胞核中的DNA甲基化与转座子的调节有关，而PTGS通过细胞质中的长双链RNA调节病毒感染。在植物中，病毒和转基因都能通过PTG诱导基因沉默，这一过程被普遍认为是植物抵御某些病毒病原体感染的组成部分。

RNA诱导DNA甲基化（RdDM）已被植物用作对抗双子病毒的表观遗传防御[4]（见图3）。在RdDM的过程中，涉及两种关键酶——RDR2和DCL3。RDR2是一种功能酶，可调节内源性植物siRNA和病毒次级siRNA的生物合成，并在RdDM途径中靶向dsRNA的转化。dsRNA被消化成大小不同的siRNA，主要是24nt（由DCL3产生）、21nt（由DCL4产生）和22nt（由DCL2产生）。不同大小的siRNA具有不同的功能，例如，24-nt siRNA（与DCL3相关）可能指导病毒DNA甲基化和转录沉默。DCL3是一种RNA酶Ⅲ样酶，属于由4个原型成员组成的家族，参与RDR最后一步，以帮助24-nt siRNA的发生。重要的是，DCL3和24-nt siRNA显然与染色质甲基化有关。

2 研究目标

分析Ty-1是否对其他双子病毒有抗性，Ty-1番茄植株将受到BCTV侵染，将其与易感MM系的含量进行比较分析。根据最新研究，Ty-1不是TYLCV的特异性，也可以对抗其他双子病毒甚至其他DNA病毒，例如，Ty-1似乎也能控制不同（双组分）双病毒物种的耐受性反应，如ToSRV。但是几乎没有关于Ty-1对其他病毒的耐药性研究[5]。

3 试验方法

3.1 植物

番茄试样MM、Ty-1、Ty-2的种子在土壤中，24 ℃和60％相对湿度的温室条件下，光照16 h、夜间8 h养护3周生长。烟草置于相同的温室条件下。在接种大约3～4周后，将番茄试样的顶部叶片采摘并在-20 ℃下储存至使用。

3.2 TYLCV，BCTV，ToSRV接种

用番茄黄叶卷曲病毒、甜菜卷曲顶病毒或番茄皱纹病毒对番茄品系进行接种。将含有该病毒克隆的根癌农杆菌（A.tumefaciens）转化并在3 mL LB3培养基中与6 μL卡那霉素和3 μL利福平抗生素一起培养。液体培养物在28 ℃温度下以180 rpm摇动过夜。第二天，将600 μL过夜培养基转移到3mL诱导培养基中，相同条件下培养。悬浮在3 mL MS-MES培养基中，样品以3 500 rpm离心20 min后充分混合。测量OD600为0.5时稀释。在温室条件下，用无针注射器加压5 mL接种，对3周龄番茄植株进行渗透。

3.3 DNA提取和PCR分析

为了确认敏感番茄试样中是否存在BCTV的DNA，设计BCTV引物进行PCR正向引物（5`-TGTAVT

VVGATVGAGCGTGTT-3`）和反向引物（5`-TCATACAA

CGAACACTTCATGA-3`），产物长度为700 bp。

从6周幼苗中分离DNA，用液氮中研磨1 g植物样后，与分离DNA缓冲液混合。用Eppendorf旋转约2 min后，以12 000 rpm的转速旋转5 min，将透明液体移到新管中。洗涤后用离心机以12 000 rpm的速度去除多余液体。向每根试管中加入30 μL的G.lig EB，等待3 min。试管在12 000 rpm下旋转2 min后准备进行PCR。使用1ul DNA提取物作为模板，检查DNA片段扩增。

4 结果

4.1 BCTV克隆成功感染Nicotiana benthamiana

BCTV对番茄品种和烟草影响不同。对于番茄而言，其会导致植株发育迟缓、变黄、叶脉膨胀变紫、向上卷曲叶片。其对烟草特有的症状是向下卷叶和发育迟缓。

在测试Ty-1是否也具有对不同于TYLCV的双子病毒的抗性之前，将BCTV的一种PGV 3850农杆菌克隆接种在本氏烟上，测试其传染性。PGV 3850接种后13 d，本氏烟下叶出现黄变、坏死等症状。为了确认是否存在BCTV，采用特异性PCR引物检测病毒的存在。结果显示预期大小为700 bp的条带，说明设计的引物对扩增BCTV有用，进一步说明本生烟已被BCTV感染。

4.2 Ty-1系列表现出对BCTV的抗性

为测试Ty-1是否也能抵抗其他双子病毒，用BCTV克隆对Ty-1番茄植株进行接种，以测定感染后的病毒含量，并与敏感MM进行比较。采用烟草响尾蛇病毒（TRV）的病毒诱导基因沉默（VIGS）方法构建了两个VIGS结构，分别用于Solyc06g051180的TRV2-180和Solyc06g051190的TRV2-190。

由于Solyc06g051180和Solyc06g051190之间同源性较低，两个VIG载体TRV2-180和TRV2-190是特异性的，并且都被假定为单个RDR。含有Ty-1的植株通过TRV2-180或TRV2-190VIG进行侵染沉默，出现TYLCV疾病症状并观察抗性受损。在用BCTV感染之前，首先用TRV2-180和TRV2-190对Ty-1植株进行接种，使VIGS沉默Ty-1并损害其抗性。作为对照，在Ty-1植株上接种TYLCV。Ty-1和MM在温室中播种，1周后移栽到不同的花盆中，用TRV2-180或TRV2-190进行接种。约3周后，感染叶片表现为发育迟缓、变黄、叶脉肿胀、变紫以及向上卷曲的叶片（见图4）。在对Ty-1进行VIG沉默的MM和Ty-1植株上，症状清晰可见，典型症状是感染TYLCV的叶片变黄和卷曲。对于受到BCTV攻击的Ty-1和MM番茄植株，这些症状表明，Ty-1的VIGS沉默（TRV2-180和TRV2-190）相对于未被VIGS沉默的Ty-1系表现出比BCTV更明显的症状，如严重发育迟缓、向上卷曲叶片、发育缓慢。相比之下，在BCTV侵染的Ty-1株系上几乎看不到症状，而少数Ty-1植株表现出与MM相似的症状。

4.3 扩增BCTV片段并进行PCR检测

为了检测感染的Ty-1番茄叶片中BCTV含量，采用qPCR方法对RV2-180/190 VIGS沉默的Ty-1植株、Ty-1植株和易感MM番茄中的BCTV滴度测定。分析前，设计了一套特定的引物，从这些感染的植物样本中PCR扩增BCTV片段，并获得约700 bp的产物。作为对照，加入TYCLV感染样本，并使用设计成功的引物进行测试，得到了300 bp的产物。 在被侵染的植物中用PCR检测BCTV的DNA（见图5），结果显示，MM株系和TRV2-180/190 VIGS沉默的Ty-1番茄植株样本分别呈现预期的DNA产物，其中TYLCV为300 bp，BCTV为700 bp。由此可以证明MM系和TRV2-180/190 VIGS沉默的Ty-1番茄植株系已感染BCTV。使用BCTV引物对所有试验植物的分离样本进行PCR，以扩增BCTV，并证明所有MM系和TRV2-180 VIGS沉默的Ty-1系均成功感染BCTV。但结果显示，其中一个Ty-1样本也感染了BCTV。

4.4 用qPCR测定BCTV有效量

BCTV的侵染成功和PCR引物的确定后，分别对Ty-1植株、感病MM番茄和TRV2-180/190 VIGS沉默的Ty-1番茄叶片样本进行qPCR检测，以确定BCTV滴度。内部对照，在Butterbach等人的TYLCV试验的Ty-1的qPCR分析中使用了GFP基因的Ty-1进行的qPCR分析相同。

根据qPCR结果，在样本中观察到不同的BCTV病毒滴度（见图6）。正如预期，从易感MM采集的大多数植物样本中普遍观察到较高的滴度，而在Ty-1中观察到较低的滴度，但样本除外。由于Ty-1的VIGS沉默在早期损害了对TYLCV的抗性，因此经类似处理（TRV2-180或TRV2-190）并随后用BCTV激发的Ty-1植株显示出比Ty-1更高的滴度以及与MM相似的滴度水平，并进一步表明Ty-1的VIGS沉默损害了对BCTV的抗性，结果表明Ty-1对BCTV具有抗性。虽然Ty-1株系的平均滴度低于对照组，但一个Ty-1株系样本显示出比其他Ty-1株系更高的含量（见图7）。

5 讨论

试验植物表现出了预期症状，BCTV的PCR结果与阳性对照（TYLCV）相同，从而证明MM、TRV2-180或TRV2-190 VIGS沉默的Ty-1系感染了BCTV。通过qPCR方法在Ty-1系中产生的较低滴度，在大多数易感MM和TRV2-180 VIGS沉默的Ty-1系中产生的滴度较高，综上结果Ty-1确实对BCTV产生了抗性。

另外，观察到一株被BCTV攻击的Ty-1番茄植株表现出易感MM番茄的症状，这株Ty-1番茄植株被BCTV感染，产生了更高的滴度。结果表明该Ty-1番茄植株不对抗BCTV，Ty-1通过增强TGS而产生抗性。可能Ty-1番茄植株不能产生足够的siRNA信号，会导致TGS抑制和RNAi沉默失败。目前尚不清楚这种新型Ty-1植物产生的原因和机制，因此在不久的将来对其进行研究将是一个挑战。

参考文献：

［1］Lapidot M，J. E. Polston.番茄对番茄黄化曲叶病毒的抗性，植物对病毒的自然抗性机制［J］.斯普林格，2006（2）：503-520.

［2］Bernstein，E.A.A.Caudy.双齿核糖核酸酶在RNA干扰起到的作用［J］.自然，2001，409（6818）：363-366.

［3］Hohn T，F.Vazquez.植物RNA沉默途径：植物DNA病毒的沉默及其抑制［J］.生物化学与生物物理学报（BBA）-基因调控机制，2011，1809（11）：588-600.

［4］Raja P.，J. N.Jackel.拟南芥双链RNA结合蛋白DRB3参与甲基化介导的双子病毒防御［J］.病毒学杂志，2013（4）：2305-2313.

［5］Boiteux，L.S.，V.R. Oliveira.携带Ty-1基因座的番茄杂交种对巴西二分体双生病毒的反应［J］.巴西园艺，2007，25（1）：20-23.