一种羊肚菌病原真菌的分离鉴定及防治措施
作者: 李宾 田芳 金丽 高翔 刘格 郑华魁 胡伟 何培新
摘 要:为探明在河南省郑州市地区危害羊肚菌较为严重的病害及病原菌种类,采集发病的羊肚菌子囊果,对病原菌进行分离培养和鉴定,并进行形态学特征观察及ITS序列比对分析。结果显示:菌丝在PDA平板上的生长速度极慢,培养14 d后,菌落为直径约为5 cm的近似圆形,菌丝浓密洁白、呈绒毛状,可见类似年轮的多层次圆圈,在40倍电子显微镜下能观察到菌丝光滑无色,分生孢子由菌丝膨大、隔膜处凹陷形成。同时,病原菌ITS序列与已公开的[DiploÖspora] longispora strain SY1和[DiploÖspora] longispora strain SY1Y2菌株的一致性达到100%,从而确定该病原菌为长卵单隔孢霉(DiploÖspora longispora),这与霉菌性枯萎病病原菌一致。为避免因该病害的暴发而造成经济损失,提出“以防为主,综合防控”的防治原则,对发生过霉菌性枯萎病的栽培场地,应采取加强土壤处理、合理轮作、科学播种、强化菌丝生长期与出菇期管理、合理使用杀菌剂等防治措施,从而促进羊肚菌产业的健康稳定发展。
关键词:羊肚菌;霉菌性枯萎病;长卵单隔孢霉;分子学鉴定
中图分类号:S436.461 文献标志码:B 文章编号:1674-7909(2024)2-71-5
DOI:10.19345/j.cnki.1674-7909.2024.02.015
0 引言
羊肚菌是一种珍稀的食药兼用真菌,其味道鲜美,含有大量的鲜味氨基酸——谷氨酸和天氨酸(二者占羊肚菌氨基酸总量的27%左右)。同时,羊肚菌的营养价值高,其优质蛋白含量在20%以上,亚油酸含量最高可达72.8%,氨基酸含量更是远高于常规食用菌[1-3],被称为“素中之荤”,深受广大消费者喜爱。相关研究表明,羊肚菌具有益肠胃、补脑提神、化痰利气、抗菌、抗氧化、抗衰老、降低胆固醇等功效,还可促进小鼠心肌损伤的恢复、预防神经退行性疾病[4-6],具有极高的药用价值。
我国从2011年开始规模化生产羊肚菌。羊肚菌因具有栽培周期短、不影响其他作物种植、生产管理简便、投资回报率高等优点,从而受到各地政府相关部门、企业和农户的青睐,其种植面积迅速扩大,从一开始的云南省、四川省等地,发展到除海南省以外的全国各省(自治区、直辖市)。2012年,全国羊肚菌种植面积为200 hm2,每667 m2的产量为50 kg;2023年,全国羊肚菌种植面为2.267万 hm2,每667 m2的平均产量为400 kg[7-9]。在羊肚菌种植面积迅速扩大的同时,将近70%的种植户处于亏损状态,造成这一问题的主要原因有菌种选择不当、栽培管理不规范、对极端性天气的防控不足及病虫害防治不科学等。不同于普通的食用菌,羊肚菌开放式的大田栽培模式及蜂窝状的子实体表面,使得栽培环境中的微生物或害虫极易附着在羊肚菌表面,从而使其容易被杂菌污染,再加上出菇期高温高湿的生长环境也会导致病虫害迅速蔓延。此外,在种植过羊肚菌或发生过病害的栽培场地中,如果不及时做好病虫害防控工作,则极易出现病虫害大面积暴发的情况,进而造成羊肚菌产量及品质下降,甚至出现绝收的情况,严重制约羊肚菌产业的发展。因此,对羊肚菌病虫害防治的研究亟待进一步加强。作为科研工作者,要使菇农知道如何提前做好土壤处理工作,从而预防病虫害发生,同时使菇农掌握病虫害处理方法,避免造成经济损失。
在羊肚菌栽培过程中,常见的病害包括软腐病、红体病2种细菌性病害和镰刀菌、霉菌性枯萎病和蛛网病3种真菌性病害,常见的害虫有跳虫、蚊蝇和蛾类幼虫、蜗牛、蛞蝓、鼠妇等[10]。由于真菌性病害具有隐蔽性强、发病速度快等特点,导致在羊肚菌栽培过程中真菌性病害的危害较大,防治难度也最大。
目前,对羊肚菌细菌性病害的病原菌研究还未见报道,对羊肚菌真菌性病害及病原菌种类的研究报道已陆续公开。He等[11]在羊肚菌子实体上首次观察到霉菌性枯萎病,并于2018年通过形态学及分子鉴定确定了霉菌性枯萎病的病原菌为长孢卵单隔孢霉(DiploÖspora longispora);刘伟[10]在2019 年发现了一种新的病害,并将其命名为“蛛网病”,还提出防治方法,但未确定该病原菌种类;2020 年,余苗等[12]发现了一种新的羊肚菌真菌性病害——白腐病,并确定病原菌为曲霉(Aspergillus);2020年,Zhang等[13]发现匐枝根霉(Rhizopus stolonifer)也会对羊肚菌的生长发育造成危害。2018—2020年,笔者通过连续调查试验基地羊肚菌病害的发生情况,在种植的第3年,发现大量被白色病原菌菌丝包裹的羊肚菌幼小子实体,甚至是刚开始分化的原基都被该种菌丝覆盖,并在出菇期迅速蔓延,严重影响了原基的分化及幼菇的发育,直接造成大面积减产,甚至绝收。为探明该病原菌的种类,多点采集发病的羊肚菌子囊果,并进行病原菌分离和鉴定,以期为病害防治提供理论支撑,同时提出更科学合理的防治措施。
1 试验材料与方法
1.1 试验材料
供试材料:发病的羊肚菌子囊果(采集地点为郑州市农业科技研究院须水试验基地);供试培养基:PDA固体培养基;主要试剂及设备:真菌基因组DNA 提取试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)、DL2000 DNA Maker和引物(均购自上海生工生物有限公司)、离心机、水浴锅、电泳仪、凝胶成像仪、PCR仪。
1.2 试验方法
1.2.1 病害特征调查及病原菌的分离
连续3年(2018—2020年)对须水试验基地的羊肚菌大棚进行病害调查,并记录发病情况。在发生羊肚菌病害的大棚内进行多点采集,并将采集到的染病子实体放入无菌自封袋内,做好标记,尽快带回实验室。在实验室超净工作台上,用无菌水冲洗病斑表面,之后用消过毒的接种钩挑取病斑处的菌丝,并接种到PDA培养基上。在22 ℃恒温培养箱中黑暗培养,待菌丝萌发后,选取菌落边缘处的菌丝转接到新的PDA培养基上,多次纯化培养后得到病原菌,并放在4 ℃冰箱中保存备用。
1.2.2 病原菌形态学观察
将活化后的病原菌用8 mm的打孔器转接到新的PDA平板上,放入22 ℃恒温培养箱中进行黑暗培养,观察菌落形态,并测量菌落直径。待其产生分生孢子后挑取菌丝,并将其置于显微镜下观察形态特征。
1.2.3 病原菌分子学鉴定
收集活化后的病原菌菌丝,并置于无菌的研钵内用液氮进行研磨,然后用真菌基因组DNA提取试剂盒(按照说明书中规定步骤)来提取菌丝体总DNA。随后合成引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')、ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'),并对病原菌进行内部转录间隔区(ITS) rDNA PCR扩增, PCR反应体系25 μL如下:E Taq mix(2X Taq PCR StarMix with)12.5 μL、上游引物(ITS1)1 μL、下游引物(ITS4)1 μL、总DNA模板1 μL、Q水9.5 μL。PCR扩增程序如下:94 ℃预变性2 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃ 延伸30 s,30个循环后在72 ℃保持 5 min,扩增完后4 ℃保存。经琼脂糖凝胶电泳检测后,将PCR回收产物送到上海生物工程基因有限公司进行DNA测序,并将测序结果上传到NCBI数据库中进行在线比对,从而确定病原菌种类。
2 结果分析
2.1 病害调查及病原菌分离
染病的羊肚菌子囊果表现症状如图1所示。病害调查显示,在试验基地大棚内,第1年出菇期未见该真菌性病害发生,第2年出菇期偶见绿霉及少量病害发生。在连续种植的第3年,不同品种中该病的发病率为60%~90%,羊肚菌大棚内出现大量幼小原基及子囊果被白色菌丝包裹的情况,菌丝呈绒毛状[见图1(a)],后期会出现白色粉末[见图1(b)]。随着时间的推移,侵染部位出现凹陷、皱缩的情况[见图1(c)],前期多发在菌盖处,也会发生在菌柄处。催菇后25 ℃以上的高温高湿环境中,该病害会快速蔓延到周围土壤中,造成成片的原基发病,并停止生长。
2.2 病原菌形态学观察
采集10株染病的羊肚菌子囊果进行分离,共得到5株病原菌(Z1~Z5)。在PDA平板上培养后发现,5株病原菌的菌落形态一致,菌丝生长速度很慢,培养3 d后的菌落直径在1.5 cm左右,培养14 d后的菌落为直径约5 cm的近圆形,菌丝浓密洁白、呈绒毛状,可见类似年轮的多层次圆圈[见图2(a)]。在40倍显微镜下观察菌丝及孢子形态,显示菌丝光滑无色,分生孢子由菌丝膨大、隔膜处凹陷形成[见图2(b)],形态特征与He等[11]的描述一致,初步鉴定该病原菌为长孢卵单隔孢霉。
2.3 病原菌分子学鉴定
选取Z1和Z2两个菌株的基因组DNA,通过PCR扩增ITS序列,电泳条带结果见图3。由图3可知,单一条带长度为500~750 bp。同时,测序结果显示,序列长度分别为550 bp、545 bp,将序列提交到NCBI中进行在线比对,确定Z1和Z2两个菌株的序列为[双孢属] 长孢属菌株[DiploÖspora] longispora strain核糖体RNA基因的部分序列,分子鉴定结果为长孢卵单隔孢霉(见表1和表2),Z1与[DiploÖspora] longispora strain SY1菌株的一致性达到100%、Z2与[DiploÖspora] longispora strain Y2菌株的相似性高达100%。将Z1和Z2的测序结果在DNA MAN上进行比对,比对结果显示,二者序列的相似性为97.82%,这2种株菌很有可能是同一株菌。结合形态学特征,可确定Z1、Z2菌株均为长卵单隔孢霉。
3 结论、讨论及防治措施
3.1 结论与讨论
传统的真菌分类鉴定主要靠形态学观察,易造成具体病原菌分类不准确,从而导致不同种类病害混淆,增加防治难度。随着分子生物学技术的普及,特别是一些保守基因序列的公布,对病原真菌的鉴定更加方便、准确。白霉病和霉菌性枯萎病的发病症状极其相似,仅靠形态学观察很难将二者区分开来,且霉菌性枯萎病的病原菌长卵单隔孢霉曾被误认为长毛拟青霉(Paecilomyces penicillatus)[14],但二者最大的差异在于长卵单隔孢霉的分生孢子有横隔,而长毛拟青霉没有横隔。因此,在对病原真菌进行分类鉴定时,要结合形态学特征和保守基因序列进行分析,从而实现更科学准确的分类。
笔者通过对染病子实体上分离的病原菌进行形态学特征分析及分子鉴定,从而确定该病原菌为长孢卵单隔孢霉,这与He等[11]首次发现的霉菌性枯萎病病原菌一致,但也有学者将霉菌性枯萎病称为菌盖干腐病。霉菌性枯萎病是一种严重的真菌性病害,以侵染菌盖为主,也会侵染菌柄,受侵染的部位会出现破损、空洞现象,造成子囊果畸形。该病原菌在环境温度高于22 ℃时极易发生,加之环境湿度大,会在1~2 d内迅速包裹整个子实体,后期会出现粉末感,甚至蔓延至周边的原基[1]。目前,在四川省、湖北省、河南省、陕西省、贵州省等地都发现该种病害。当前大面积推广的六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、梯棱羊肚菌品种易感染的霉菌性枯萎病[10]是羊肚菌栽培过程中危害最严重的三大真菌性病害之一,防治难度大,给菇农造成极大损失,还未见有效的药剂防治方法,以预防为主。
3.2 防治措施
目前,对霉菌性枯萎病的病原菌种类及培养特性的研究被陆续报道出来,但对霉菌性枯萎病病原菌的防治措施及有效药剂筛选的研究相对较少,再加上羊肚菌和长卵单隔孢霉同为真菌,因而对霉菌性枯萎病的防治较为困难。王帮香[15]探究了大蒜、朝天椒、花椒、生姜、鱼腥草等抑菌蔬菜和中草药植物提取物对羊肚菌真菌性病害的抑制效果,但并未提到霉菌性枯萎病,可进一步研究。付博等[16]和黄慧等[17]先分离霉菌性枯萎病的病原菌,通过形态学特征、致病性特征和ITS序列比对,再次确认病原菌分类为长孢卵单隔孢霉,同时对长卵单隔孢霉的培养特性进行探究,确定最适培养基、碳源、氮源、pH值及生长温度。黄慧等[17]提出当pH 值超过8时,会抑制羊肚菌菌丝的生长,且其认为目前普遍使用的生石灰覆盖消毒并不能有效控制霉菌性枯萎病在土壤中的蔓延,还会降低羊肚菌产量,并根据长卵单隔孢霉对高温的敏感,提出采收后采取火焰高温燃烧方式对发病后的栽培地土壤进行全面消毒,从而杀死其中潜在的病原菌。杨春等[18]通过菌丝平板培养和大田喷施试验,发现一种口腔护理中的抑菌成分——三氯生(TCS),可有效抑制未灭菌环境中杂菌的生长,长卵单隔孢霉的分生孢子会随着TCS浓度的增加而发生破裂死亡。在对染病子实体喷施TCS(40 mg/L)后,可避免长卵单隔孢霉向周边土壤的扩散,在发病早期,可用40 mg/L的TCS悬浮液直接喷施到感染霉菌性枯萎病的子囊果上面,能阻止病原菌的蔓延。方磊等[19]探究了10种常见杀菌剂与生石灰复配后的制剂对长卵单隔孢霉的抑制效果,发现用0.25 g/L百菌清与1.2 g/L生石灰制成的复配制剂对病原菌的抑制率达到72.73%,同时对羊肚菌菌丝无显著抑制,可用于对该病害的防治。但上述研究中的杀菌剂还未在生产中进行推广应用,其应用效果还有待进一步验证。