河南省西峡县鸡源沙门氏菌分离鉴定及药敏性检测

摘 要：为探究河南省南阳市西峡县鸡源沙门氏菌的流行及耐药性情况，对来自养鸡场的疑似感染鸡沙门氏菌的病死鸡的54份病料组织进行分离菌培养及镜检、生化鉴定反应和PCR鉴定，并检测所有分离菌株对14种抗生素的耐药性。检测结果显示，共分离出18株鸡沙门氏菌，检出率为33.33%；其中，鸡白痢沙门氏菌有12株，肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌各3株；分离出的菌株对氯霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、庆大霉素的耐药性较高，对四环素、头孢噻肟、环丙沙星、红霉素、头孢吡肟较敏感，耐药种类分布在1种到8种之间，多重耐药率为88.89%（16/18），以耐5种抗生素的菌株最多。研究结果可为西峡县沙门氏菌流行态势的评估和防治措施的制定提供参考。

关键词：鸡；沙门氏菌；分离鉴定；耐药性

中图分类号：S852.61 文献标志码：B 文章编号：1674-7909（2024）2-101-4

DOI：10.19345/j.cnki.1674-7909.2024.02.023

0 引言

鸡沙门氏菌病是由沙门氏菌（Salmonella）引起的、广泛存在于养鸡场中的细菌性疾病。雏鸡感染该病菌后，会出现腹泻、消瘦、脱水症状；母鸡感染该病菌后，会出现卵囊炎、腹膜炎症状，产蛋率下降，且发病率和死亡率较高，从而给养鸡业带来严重的经济损失［1］。沙门氏菌属肠杆菌科，是一种人畜共患的革兰氏阴性菌和条件致病菌，通常寄生在动物和人类的肠道内，在宿主机体免疫力下降、外界环境变化时会成为优势菌，并导致宿主发病。沙门氏菌可通过污染的饮水、饲料、饲用器具和粪污等在鸡群中进行水平传播，还能通过感染受精卵进行垂直传播。沙门氏菌血清型众多，迄今为止已发现2 600多种血清型，我国主要流行的沙门氏菌血清型为鸡白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌［2-3］。不同地区不同时期流行的沙门氏菌血清型不一致，明确当地流行的沙门氏菌血清型对实现沙门氏菌病的有效防治具有重要指导意义。抗生素可用于防治家禽的多种疾病，能提高家禽生产性能、降低饲料成本和疾病发生风险，但长期不合理使用抗生素会导致耐药菌株日益增多，且形成多种耐药性，严重影响抗生素的临床应用效果。对当地流行菌株的耐药性进行检测，可为临床合理使用抗生素提供参考，从而提高抗生素药效。笔者通过调查河南省南阳市西峡县部分养鸡场，对当地鸡源沙门氏菌流行的血清型进行鉴定，并对养鸡场常用抗生素的耐药性进行检测分析，为鸡沙门氏菌病的防治提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 临床病料采集及质控菌株

无菌采集西峡县5家养鸡场内疑似患沙门氏菌病死亡的鸡的心、肝、肠等器官组织，共54份，并装袋编号送检。以大肠埃希菌ATCC25922为标准质控菌株（购自广东环凯微生物科技有限公司）。

1.2 主要培养基和试剂

测试所用的材料包括缓冲蛋白胨水（BPW）、麦康凯琼脂培养基（MAC）、LB固体培养基（均购自青岛青药生物工程有限公司），细菌基因组DNA提取试剂盒、细菌生化鉴定管（均购自北京索莱宝科技有限公司），DL 2000 DNA Marker、2×Taq PCR Master Mix（均购自北京百奥莱博科技有限公司），药敏纸片（购自杭州滨河微生物科技有限公司）。

1.3 分离菌培养及镜检

在无菌环境中挑取病料，并将其接种于缓冲蛋白胨水中进行预增菌。将菌悬液分别接种于LB固体培养基、麦康凯培养基中，于37 ℃下培养18～24 h，观察菌落特征。挑取特征菌落进行革兰氏染色，并对涂片进行镜检，观察分离菌的形态特性。

1.4 生化鉴定反应

按照细菌生化鉴定管操作说明书中的要求，将上述增菌液接种于生化反应鉴定管中，并观察反应结果，根据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2016）［4］中的要求对反应结果进行判断。

1.5 PCR鉴定

参照文献［5］～［7］，设计invA、stn、sdf、P1、P2、STM4497共6对引物（引物的基本信息见表1），用来对沙门氏菌血清型进行鉴定，引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司。用细菌基因组DNA提取试剂盒来提取增菌液中的DNA，并以此为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为分离菌1 μL、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O补足至25 μL。PCR反应程序如下：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性35 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共运行35个循环，最后72 ℃延伸8 min。取部分扩增产物，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，并将结果在Genbank数据库经BLAST比对。

1.6 药敏试验

参考美国临床和实验室标准协会（CLSI）推荐的K-B纸片法，检测沙门氏菌对氯霉素、青霉素、头孢噻肟、头孢吡肟、多西环素、氟苯尼考、卡那霉素、庆大霉素、红霉素、四环素、左氧氟沙星、复方新诺明、多黏菌素、阿米卡星等14种抗生素药物的耐药性。检测试验以大肠埃希菌ATCC25922为对照组。将吸取到的菌悬液均匀地涂布在LB固体营养琼脂平板上，并在表面平铺药敏纸片（纸片之间要保持适当距离），于37 ℃恒温培养16～24 h，然后测量抑菌圈直径，并判定沙门氏菌对每种抗生素的敏感（S）、中介（I）和耐药（R）。

2 结果与分析

2.1 分离菌培养及镜检

对病料分别进行接种和培养后，分离菌菌落形态与镜检结果如图1所示。由图1可知，接种分离菌的LB固体培养基和麦康凯培养基会形成边缘整齐、表面无色透明的菌落。革兰氏染色镜检结果见图1（c），分离菌为单个分散或数个聚集分布、两端钝圆的阴性菌，共有18个菌落的形态和镜检特征基本符合沙门氏菌特性。

2.2 生化鉴定反应

细菌微量生化鉴定反应结果见表2。有18株分离菌发酵为葡萄糖、鸟氨酸、赖氨酸脱羧酶，6株分离菌具有运动性，7株分离菌发酵为卫矛醇，18株分离菌不发酵乳糖，且尿素和氰化钾试验为阴性，上述结果与沙门氏菌生化特性一致。根据伤寒沙门氏菌不发酵鸟氨酸的生化特点，且分离菌株均不能发酵鸟氨酸，所以判断分离菌株不含鸡伤寒沙门氏菌。结合鸡白痢沙门氏菌无运动性的特性，判断有12株鸡白痢沙门氏菌。综上所述，18株分离菌中有12株鸡白痢沙门氏菌，6株为副伤寒沙门氏菌。

2.3 PCR扩增

经PCR扩增鉴定后，18株分离菌均可得到长约为605 bp、260 bp的目的条带，分别与invA和stn基因符合，这表明18株分离菌均为沙门氏菌属，见图2（a）；12株分离菌均可获得长约为417 bp的目的条带，与P1基因符合，表明这12株分离菌为鸡白痢沙门氏菌，见图2（b）；3株分离菌均可获得长约为203 bp的目的条带，与sdf基因符合，表明这3株分离菌为肠炎沙门氏菌，见图2（c）；3株分离菌均可获得长约为523 bp的目的条带，与STM4497基因符合，表明这3株分离菌为鼠伤寒沙门氏菌，见图2（d）。未见同时扩增获得P1和P2基因条带，这表明分离菌中无鸡伤寒沙门氏菌。将基因测序结果在Genbank数据库内经BLAST比对可知，核酸相似性在97.6%以上。

2.4 药敏试验

对18株分离菌进行14种抗生素耐药性K-B法检测，结果见表3。分离菌株对氯霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、庆大霉素的耐药性比较严重，耐药率为62.31%～81.98%；对四环素、头孢噻肟、环丙沙星、红霉素、头孢吡肟比较敏感，敏感率在50%以上。分离菌株耐药种类分布如图3所示，耐药种类分布在1种到8种之间，多重耐药率（耐3种及3种药物以上）为88.89%（16/18），以耐5种抗生素最多，耐药率为27.78%（5/18）。

3 结论

沙门氏菌广泛存在于自然界，是影响畜牧业发展的常见病原菌，也是重要的食源性人畜共患病病原菌之一，并具有多重耐药性，对全球公共卫生安全构成威胁［8］。通过对采集自西峡县部分养鸡场疑似感染沙门氏菌病的病死鸡的54份器官组织病料进行细菌培养、生化试验和PCR扩增反应，鉴定出18株鸡沙门氏菌，检出率为33.33%（18/54），这表明鸡沙门氏菌病在当地较为流行。杨瑞等［9］研究发现，秦皇岛地区鸡源沙门氏菌的分离率为17.06%；宋欣媛等［10］研究发现，昆明周边养鸡场沙门氏菌感染率为16.00%。各地区鸡源沙门氏菌的检出率不同，可能与养殖环境、采样部位、时间、菌株流行程度等因素有关。沙门氏菌的血清型不同，其致病力也存在差异，确定一个地区的鸡沙门氏菌血清型有助于疫苗研发和提高防治成效。笔者对18株沙门氏菌进行异性引物PCR扩增和测序验证，发现12株为鸡白痢沙门氏菌，3株为肠炎沙门氏菌，3株为鼠伤寒沙门氏菌，表明西峡县鸡沙门氏菌流行的优势菌株为鸡白痢沙门氏菌。这可为下一步防治明确重点方向。此研究结果与巩新廷等［11］、宋艳等［12］的研究结果基本一致。

由于长期不规范使用抗生素，鸡沙门氏菌的耐药性较高，严重降低了抗生素的治疗效果。此研究结果表明，从西峡县部分养鸡场分离的18株鸡源致病性沙门氏菌均具有耐药性，耐药种类分布在1种到8种之间，且多重耐药率（耐3种及3种药物以上）为88.89%（16/18），以耐5种抗生素的菌株最多，且对氯霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、庆大霉素耐药性比较严重，对四环素、头孢噻肟、环丙沙星、红霉素、头孢吡肟较为敏感。这可能与当地养鸡场临床使用抗生素习惯、饲养管理模式和菌株致病力等有关。耐药性研究结果表明，西峡县鸡源致病性沙门氏菌的耐药情况较为严重，多重耐药率较高，可通过轮换用药、选用敏感性药物、使用抑菌中草药等方式来防治鸡沙门氏菌病，避免细菌的耐药性进一步增强。

参考文献：

［1］撒朗文朱.四川部分地区禽沙门氏菌分离鉴定、耐药表型及全基因组序列分析［D］.成都：西南民族大学，2022.

［2］施开创，李凤梅，邹联斌，等.鸡源致病性沙门氏菌的分离鉴定及血清型和药物敏感性分析［J］.中国畜牧兽医，2015（8）：2160-2168.

［3］杨文文，李玉保，路建彪，等.山东省鸡源沙门氏菌的分离鉴定及毒力基因分析［J］.中国畜牧兽医，2021（8）：3069-3078.

［4］中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验：GB4789.4—2016［S］.2016.

［5］范忠军，许保疆，翟崇凯，等.鸡源肠炎沙门氏菌快速检测方法的建立及其分离株的耐药性分析［J］.河南农业科学，2017（10）：137-142.

［6］王迪轩，高东阳，张天姿，等.华中地区鸡源沙门氏菌分离鉴定及耐药性分析［J］.中国畜牧兽医，2019（3）：931-939.

［7］朱春红，陶志云，刘宏祥，等.鸡白痢与鸡伤寒沙门氏菌双重PCR方法的建立和初步应用［J］.中国兽医杂志，2019（8）：74-76.

［8］POPY N N，HOQUE M N，KHAN M F R，et al.Draft genome sequencing of a multidrug-resistant Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium strain isolated from chicken in Bangladesh［J］.Microbiol Resour Announc，2024（1）：e00619-23.

［9］杨瑞，何云凤，刘梦雪，等.秦皇岛地区鸡源沙门氏菌的分离鉴定及耐药性检测［J］.黑龙江畜牧兽医，2022（4）：64-68，136.

［10］宋欣媛，谭珊，吴培福.昆明地区鸡源沙门氏菌的分离鉴定及耐药性分析［J］.现代畜牧兽医，2019（4）：1-5.

［11］巩新廷，石岩，苏玉贤.河南省部分地区鸡源沙门氏菌分离鉴定与耐药性分析［J］.中国动物传染病学报，2022（6）：153-157.

［12］宋艳，张富友，顾小雪，等.山东济宁地区百日鸡群沙门氏菌的鉴定及耐药特性研究［J］.中国预防兽医学报，2021（1）：21-28.