尖尾芋一未知叶部病害的病原菌分离与鉴定
作者: 张少天
摘 要:为明确重庆市万州区种植的尖尾芋出现的一种叶部病害病原菌的种类,采集受病原菌感染的尖尾芋叶片样本,并对样本进行表面消毒处理,成功分离出病原菌。对该病原菌进行培养和纯化处理,最终得到纯化后的病原菌菌株。对该病原菌菌株进行形态学观察和生理生化试验,初步确认该病原菌为真菌。通过DNA序列分析和比对,最终确定该病原菌为平头炭疽菌。
关键词:尖尾芋;炭疽病;分离鉴定;平头炭疽菌
中图分类号:S432.1 文献标志码:B 文章编号:1674-7909(2024)6-78-6
DOI:10.19345/j.cnki.1674-7909.2024.06.016
0 引言
尖尾芋[Alocasia cucullata(Lour.)Schott]又名老虎芋、大麻芋,是天南星科(Araceae Juss.)海芋属(Alocasia)植物[1],生品有毒,以根茎入药,具有清热解毒、消肿镇痛的功效[2],内服可治疗高热不退、流感和肺结核等疾病,外敷可治疗疔疮、烫火伤、毒蛇咬伤和毒蜂蜇伤等[3],也是一种观赏植物。在种植尖尾芋过程中,常见的病害有褐斑病、炭疽病、灰霉病、叶斑病,会导致尖尾芋叶片出现斑点、枯萎、腐烂等症状,严重影响尖尾芋的产量和品质,并造成较大的经济损失[4]。
2022—2023年,在重庆市万州区种植的尖尾芋出现一种叶部病害,发病部位失绿变为灰白色,后期出现穿孔破损的现象,且之前没有此类病害的报道。
1 材料与方法
1.1 材料
从重庆市万州区(东经108°22′、北纬30°32′)尖尾芋种植基地采集具有典型症状的尖尾芋叶片作为供试病样。试验使用马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基,其配制方法如下:取马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g,加水定容至1 000 mL,于121 ℃下用高压蒸汽灭菌20 min[5]。
1.2 方法
1.2.1 病原菌分离与纯化
采用常规组织分离法[6]对采集到的、具有典型症状的叶片进行分离。在病健交界处剪取5 mm×5 mm的组织块,先用75%乙醇对其消毒30 s,之后用无菌水清洗1次,再用5%次氯酸钠对其浸泡3 min,并用无菌水清洗3次。用无菌滤纸将样品表面的水分吸干,将其接种到PDA培养基上,并置于28 ℃培养箱中暗培养5 d,用单孢分离法对病原菌进行纯化处理[7]。
1.2.2 外貌特征检查
将纯化后的菌株置于新的PDA平板上,在28 ℃培养箱中暗培养7 d,观察并记录菌落的形态[8]。在显微镜下观察分生孢子、分生孢子盘,并测量分生孢子的大小(n=50)。
1.2.3 病原菌分子生物学鉴定及系统发育树构建
用真菌基因组DNA抽提试剂盒[购自生工生物工程(上海)股份有限公司]提取病原菌的DNA。选用ITS、ACT、CHS-1、TUB2、GAPDH引物(见表1)对病原菌进行PCR扩增,并将扩增后的产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,将测序结果与NCBI中的BLAST进行对比,下载相关序列后,用MEGA11软件对扩增后的序列进行单基因序列对齐与剪切,使用PhyloSuite软件将扩增序列按ITS-GAPDH-CHS-1-ACT-TUB2的顺序进行拼接,并利用最大似然法(Maximum Likelihood,ML)来构建多基因系统发育树。
1.2.4 致病性测定
将纯化后的菌株在PDA培养基上培养7 d,并制备成直径为5 mm的菌饼。选取健康成熟的尖尾芋叶片,用无菌接种针在尖尾芋叶片主脉两侧对称穿刺2次,并将菌饼正面紧贴在叶片一侧穿刺处,在主脉另一侧穿孔处接种相同规格的无菌PDA块(作为对照),重复3次。接种后,将叶片放在温度为28 ℃、相对湿度为85%的恒温恒湿箱中进行培养,观察并记录叶片的发病情况,直至叶片出现与田间相似的症状为止,对病斑再次进行分离鉴定,确定其与提取的病原菌是否一致,从而完成科赫法则验证[14]。
2 结果与分析
2.1 病害症状
种植的尖尾芋于5— 6月开始发病,7—8月重庆市气温升高,该病发病严重,重病区的发病率可达45%。感染该病后,症状主要出现在叶片的中下部,会出现不规则的片状病斑,边缘呈水渍状,中央失绿变为灰白色,后期穿孔破损,严重时病斑会连接成片,甚至会造成叶片坏死。尖尾芋炭疽病田间症状如图1所示。
2.2 病原菌的外貌特征
在PDA培养基上,该病原菌菌落呈圆形,表面光滑且质地较为湿润,边缘较为模糊。尖尾芋炭疽病病原菌形态特征如图2所示。菌落外层为灰白色,边缘欠规则,中层为黄棕色,中心层为棕褐色,菌落中层和中心层上有不规则的白色浓密菌丝缠绕;刚毛为黑色,呈尖状突起;分生孢子为浅绿色,类似于新月形或镰刀形,两头钝尖,大小为(15.32~28.51 μm)×(3.04~6.23 μm)[15]。
2.3 致病性测定
健康叶片在接种菌饼后的第3 d开始出现黄褐色病斑,病斑直径为11~13 mm。而接种PDA琼脂块的一侧仅有刺伤,没出现其他病变[16]。接种病原菌后的尖尾芋叶片上的病症如图3所示。试验结果表明,在接种菌饼7 d后,接种叶片的发病症状与田间自然发病的症状相似度非常高。从病变组织中重新分离病原菌,经过纯化和分子鉴定后,能成功分离出与供试菌株相同种类的病原菌,这一结果进一步验证了科赫法则[17]。
2.4 病原菌系统发育树构建
用最大似然法来构建进化树,结果如图4所示,建立进化树需要用到的登录号见表2。多基因分析结果表明,菌株JWY8、JWY14、JWY18与平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)CBS 120709聚在一支,支持率为100%,将测序结果提交至NCBI/GenBank,从而获得登录号。结合形态学鉴定结果,从而将重庆市万州区种植的尖尾芋感染的炭疽病病原菌鉴定为平头炭疽菌(C. truncatum)。
3 结束语
笔者结合形态学特征和多基因联合分析,确定重庆市万州区种植的尖尾芋感染的炭疽病病原菌为平头炭疽菌。这是由平头炭疽菌引起尖尾芋炭疽病的首次报道。平头炭疽菌是较为常见的致病菌,在大豆[18]、花生[19]和辣椒[20]等作物生长过程中均有发生。1961年,美国植物病理学家Jenkins等在利马豆上首次发现平头炭疽菌,并将其认定为一个单独的种类[21]。2012年,Lachado等[22]在研究时发现,不同来源的平头炭疽菌在形态学、生理特征和遗传水平上存在较大差异,从而将其认定为一个复合种。平头炭疽菌复合种包括短孢炭疽菌(C. brevisporum)[23]、尖孢炭疽菌(C. acutatum)[24] 、平头炭疽菌(C. truncatum)[22]和球花炭疽菌(C.incanum)[25]等。其中,平头炭疽菌是炭疽菌复合种的代表性种类[22]。
炭疽病是一种常见的植物病害,由炭疽菌引起。炭疽菌是农业生产中常见的致病菌,寄主范围广、变异丰富,对植物生长发育和产量造成严重危害。炭疽病可使植物叶片、茎、果实等部位发生病变,从而严重影响农作物的产量和品质。炭疽菌通过孢子在植物之间传播,易在潮湿环境下扩散。因此,对炭疽病的防治显得至关重要。采用合理的病害防控措施(如早期发现、清除病原菌、合理施肥、选用抗病品种等),能有效减轻炭疽病对农作物的危害。
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