畜禽产品中氟喹诺酮类药物残留检测方法的优化

摘 要：由于《动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测-高效液相色谱法》中的前处理方法步骤繁杂，为了提高检测效率，对前处理方法进行优化，并探究不同提取方式、净化方式对畜禽产品中氟喹诺酮类药物残留量的影响。选用不同固相萃取柱，通过优化提取方式、洗脱液体积及比例来处理鸡肉样品，并用高效液相色谱法检测鸡肉中氟喹诺酮类药物的残留量，从而探索出最佳的前处理方法。试验结果表明，最佳提取方法为1次涡旋提取，即先用3 mL提取液过安捷伦C18固相萃取柱，再用磷酸溶液/三乙胺-乙腈（70＋30）进行洗脱。该提取方法的前处理时间短、回收率高，可用来对畜禽产品中残留的氟喹诺酮类药物进行检测。

关键词：动物性食品；氟喹诺酮；回收率；高效液相色谱法

中图分类号：S859.84 文献标志码：B 文章编号：1674-7909（2024）6-101-4

DOI：10.19345/j.cnki.1674-7909.2024.06.022

0 引言

氟喹诺酮类药物是奎诺酮类药物加氟改造后的衍生物。氟喹诺酮类药物通过与DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ产生反应，从而生成一种新物质，能有效抑制细菌DNA旋转酶的作用，并对DNA的正常形态和功能产生影响，阻碍DNA的正常复制、转录、转运与重组，最终加速细菌死亡，从而快速杀死细菌［1］。在畜牧、家禽、水产养殖行业中，使用较多的氟喹诺酮类药物有环丙沙星、恩诺沙星、达氟沙星、沙拉沙星、诺氟沙星、氧氟沙星等，具有吸收好、组织浓度高、半衰期长、价格低廉等优点。

目前，对动物性食品中的氟喹诺酮类药物残留量的测定法有微生物法［2］、高效液相色谱法［3］、液相色谱-质谱联用法［4］。《动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测-高效液相色谱法》（农业部1025号公告14-2008）［5］中的样品前处理操作步骤较多，且回收率不高。为了实现对畜禽产品中的氟喹诺酮类药物的最大化检出，同时提高检测效率，对样品处理的提取方式、洗脱液体积和比例、固相萃取柱进行优化。通过对比优化前后的氟喹诺酮类药物的回收率，从而探索出对畜禽产品中氟喹诺酮的残留量用时少、回收率高的检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料：不含氟喹诺酮类药物的鸡肉（购自农贸市场）；供试药剂：甲醇中盐酸环丙沙星（批号GSB05-3337-2016）、甲磺酸达氟沙星［批号GBW（E）100475］、甲醇中恩诺沙星（批号GSB05-3336-2016）、甲醇中沙拉沙星［批号GBW（E）083590标准物质］，供试试剂：乙腈、甲醇（色谱纯）、磷酸、三乙胺、氢氧化钠、磷酸二氢钾（分析纯）。

1.2 试验器材

试验用到的器材有微孔滤膜（0.45 μm）、不同品牌的C18固相萃取柱（100 mg/mL）、Agilent1220液相色谱仪（配有荧光检测器，安捷伦品牌仪器）、离心机（TG16G，购自天津广丰科技有限公司）、振荡器（XW-80A，购自上海精科实业有限公司）、电子分析天平（CP214，购自奥豪斯仪器有限公司）、组织匀浆机（RCD-1A，购自金坛区白塔新宝仪器厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

参照《动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测-高效液相色谱法》（农业部1025号公告14-2008）（以下简称“标准”）中的方法进行测定，色谱柱：C18 250 mm×4.6 mm（i.d），粒径为5 μm；检测波长：激发波长为280 nm、发射波长为450 nm；流速为1 mL/min、柱温为28 ℃、进样量为20 μL；流动相：0.05 mol/L磷酸三乙胺溶液-乙腈（82＋18，v/v）。使用前，用微孔滤膜进行过滤，并超声排气泡。

1.3.2 标准曲线制备

准确量取适量的环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星和沙拉沙星的标准工作液，用流动相稀释成浓度为0.005 μg/mL、0.010 μg/mL、0.050 μg/mL、0.100 μg/mL、0.300 μg/mL的标准对照溶液，分别吸取20 μL进样，建立回归方程。

1.3.3 样品提取和净化

样品提取过程如下：准确称取2.00 g±0.05 g试料，并用10.0 mL磷酸盐缓冲溶液提取，离心，转移上清液后待用；再用10.0 mL磷酸盐缓冲溶液重复提取一次，合并2次上清液。

样品净化过程如下：依次用甲醇（2.0 mL）、磷酸盐缓冲溶液（2.0 mL）对固相萃取柱进行预洗；取5.0 mL上清液过柱，再用1.0 mL水淋洗后挤干；用1.0 mL流动相洗脱后挤干，收集洗脱液，并用高效液相色谱仪对滤膜过滤后的洗脱液进行测定。

1.3.4 不同提取方式对鸡肉中氟喹诺酮类药物残留量的影响试验

将标准中前处理的2次匀浆和振荡改为用20 mL一次涡旋提取，并对鸡肉中环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星的回收率和相对标准偏差进行计算。

1.3.5 不同洗脱液体积对鸡肉中氟喹诺酮类药物残留量的影响试验

分别用2 mL、3 mL、4 mL、5 mL洗脱液对样品进行洗脱，样品挤干后收集洗脱液。经微孔滤膜过滤后作为试样溶液，并用高效液相色谱仪对试样溶液进行测定。

1.3.6 不同比例的洗脱液对鸡肉中氟喹诺酮类药物残留量的影响试验

将原方法中的洗脱液［磷酸溶液/三乙胺-乙腈（82＋18，v/v）］的比例浓度改为90+10、85+15、81+19、75+25、70+30、65+35、60+40，并测量鸡肉中环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星的回收率和相对标准偏差。

1.3.7 不同固相萃取柱对鸡肉中氟喹诺酮类药物残留量的影响试验

用不同品牌、同样规格的固相萃取柱对样品进行萃取。取5 mL样品上清液，并用3 mL洗脱液对样品进行洗脱，收集洗脱液，测定喹诺酮类药物残留量。

2 结果与分析

2.1 色谱分析

达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星对应的色谱分离效果如图1所示，标准曲线、线性方程、相关系数、检出限见表1。

2.2 不同优化处理结果分析

2.2.1 提取方式优化对鸡肉中氟喹诺酮类药物回收率的影响

把标准前处理中的2次匀浆和振荡改为用20 mL一次涡旋提取，测得的鸡肉中环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星的回收率和相对标准偏差见表2。由表2可知，4种氟喹诺酮类药物一次提取的回收率为61.9%～75.2%，通过计算平均添加回收率，达到该标准规定的60%～100%；相对标准偏差（RSD）为0.53%～3.41%，表明该方法能满足鸡肉中氟喹诺酮类药物的检测要求。

2.2.2 洗脱液体积优化对鸡肉中氟喹诺酮类药物回收率的影响

不同体积的洗脱液过柱用时和测得鸡肉中环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星的回收率见表3。由表3可知，4 mL、5 mL洗脱液的过柱用时较长，均在5 min以上，且易造成堵塞；用2 mL洗脱液过柱时的回收率稍偏低；用3 mL洗脱液过柱时，用时合理，且回收率较好。

2.2.3 洗脱液比例优化对鸡肉中氟喹诺酮类药物回收率的影响

用不同比例的磷酸溶液/三乙胺-乙腈溶液来洗脱，测得的鸡肉添加回收率见表4。由表4可知，当乙腈比例太低时，回收偏低；当乙腈比例太高时，回收同样偏低。而标准中流动相磷酸溶液/三乙胺-乙腈（82＋18，v/v）洗脱柱也不是最理想的，用磷酸溶液/三乙胺-乙腈（70＋30，v/v）洗脱的回收率最高，这与胡永萍等［6］的研究相吻合。

2.2.4 固相萃取柱优化对鸡肉中氟喹诺酮类药物回收率的影响

用不同品牌同样规格的固相萃取柱进行试验，回收率见表5。由表5可知，安捷伦固相萃取柱的回收率最高，其余的固相萃取柱的回收率都较低，甚至达不到标准中规定的60%～100%。在实际试验中，常用国产固相萃取柱，这是因为国产固相萃取柱的价格便宜，又能满足试验要求，性价比高。但在该试验中，A-1、A-2、A-3、A-4、B-1的收率均达不到试验要求，而安捷伦固相萃取柱（原Varian C18）的回收效果更好，回收效率达到要求。

3 结束语

在使用标准中的检测方法对氟喹诺酮类药物的残留量进行检测时，由图谱可知，药物分离度高、峰形好，但回收率偏低，且操作烦琐，使用的器材较多，用时较长。在对样品进行处理时，对检测方法进行优化，结果表明，通过改变洗脱液的比例、浓度，得到的回收率不同，用磷酸溶液/三乙胺-乙腈（70＋30，v/v）洗脱的回收率最好，回收率提高近15个百分点。通过将前处理过程中的匀浆和振荡方式改为剧烈涡旋方式，对回收率的影响不大，且无明显规律改变，但可节省18 min。用3 mL过柱时，用时少，且回收率也好；用2.0 mL流动相洗脱时的回收率更高。在过柱时，安捷伦C18柱（原Varian C18）的回收率满足要求，而用其他几种固相萃取柱在过柱时，回收率都达不到标准规定的60%～100%。

参考文献：

［1］OPPEGARD L M，SCHWANZ H A，TOWLE T R，et al.Fluoroquinolones stimulate the DNA cleavage activity of topoisomerase Ⅳ by promoting the binding of Mg（2+） to the second metal binding site［J］.2016（3）：569-575.

［2］SCHNEIDER J M，DONOGHUE J D.Multiresidue analysis of fluoroquinolone antibiotics in chicken tissue using liquid chromatography-fluorescence-multiple mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography B，2002（1）：83-92.

［3］SRINIVAS N，NARASU L，SHANKAR B P，et al.Development and validation of a HPLC method for simultaneous quantitation of gatifloxacin，sparfloxacin and moxifloxacin using levofloxacin as internal standard in human plasma： application to a clinical pharmacokinetic study［J］.2010（11）：1288-1295.

［4］李维铖，姬长云，张静洁，等.高效液相色谱法检测鸡肉中氟喹诺酮类药物残留量前处理方法的优化［J］.华南农业大学学报，2014（05）：14-18.

［5］中华人民共和国农业部.动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测高效液相色谱法：农业部1025号公告-14-2008［S］.2008.

［6］胡永萍，徐克功，余舒宁，等.高效液相色谱荧光法测定鸡肉及鸡蛋中4种喹诺酮类药物残留量的研究［J］.畜牧与兽医，2017（11）：47-51.

作者简介：崔旭东（1987—），男，硕士，农艺师，研究方向：农产品质量安全检测及农业品牌建设。