水产品金黄色葡萄球菌平板计数法结果影响因素分析

作者: 许志瑛 厉君悄 夏苗苗 王娇华 李加亮

水产品金黄色葡萄球菌平板计数法结果影响因素分析0

摘 要:根据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验(GB 4789.10—2016)》第二法开展水产品(冻鱿鱼)检验时,发现在Baird-Parker平板上选取的4个可疑菌落以革兰氏阳性杆菌菌落居多,此情况容易造成在后续鉴定过程中挑取的非金葡菌落概率增加,从而影响鉴定结果的准确性。故挑取血平板上由Baird-Parker平板典型菌落划线接种培养得到的典型及可疑金葡菌落再次进行确认及鉴定,并根据鉴定结果分析探讨影响结果准确性的因素,以提高实验室对金葡的检测能力。

关键词:金黄色葡萄球菌平板计数法;水产品;鉴定结果;影响因素

中图分类号:TS201.3 文献标志码:B 文章编号:1674-7909(2024)9-155-3

DOI:10.19345/j.cnki.1674-7909.2024.09.036

0 引言

金黄色葡萄球菌是生活中最常见的病原菌之一,为革兰氏阳性球菌,无芽孢,无荚膜,能产生血浆凝固酶[1-3]。人若食用了感染金黄色葡萄球菌的水产品,会出现起头晕、恶心、腹泻、呕吐等急性肠胃炎症状[4]。为确保水产品食用安全性,在根据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验(GB 4789.10—2016)》[5]第二法开展水产品(冻鱿鱼)检验时,检测人员需对检测结果做出正确判断,对检测过程中出现的可能影响鉴定结果的因素进行分析和讨论,并采取可行性对策,提升相应检测水平。

1 材料与方法

1.1 培养基与试剂

生理盐水,批号:20230811(国药集团化学试剂有限公司);Baird-Parker琼脂,批号:20230927(青岛海博生物技术有限公司);血琼脂平板:豆粉琼脂,批号:20230912(青岛海博生物技术有限公司);脱纤维羊血,批号:20240221(青岛海博生物技术有限公司);营养琼脂,批号:20230819(青岛海博生物技术有限公司);革兰氏染色试剂盒,批号:20230701(青岛海博生物技术有限公司);冻干兔血浆,批号:20240117(青岛海博生物技术有限公司)。

1.2 菌株信息

金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、表皮葡萄球菌[CMC(B)26069],均采购于上海鲁徽科技有限公司。

1.3 试验材料

水产品为冻鱿鱼,其来源为检样。

1.4 仪器设备

电子天平[奥豪斯仪器(常州)有限公司],高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂),超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司),生物安全柜(LIFESCIENCES GROUP),生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.5 检验方法

1.5.1 样品稀释

称取25 g鱿鱼加入含225 mL生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打均质90 s,制成1∶10(体积比)的样品匀液。再用1 mL无菌吸管吸取1∶10样品匀液沿管壁缓慢注于盛有9 mL生理盐水的无菌试管中,振摇试管,混匀,制成1∶100(体积比)样品匀液,按上述操作,依法制备10倍系列稀释比样品匀液。

1.5.2 样品接种

选择1∶100、1∶1 000、1∶10 000(体积比)的样品匀液,每组试验分别吸取1 mL样液,按0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接种量接种于3块B-P平板上(用L形无菌涂布棒涂布平板,涂布时避免触及平板边缘)。涂布后的平板静置于36 ℃培养箱40 min,待样品匀液被吸收后,倒置平板,培养48 h。

金黄色葡萄球菌在B-P平板上呈圆形湿润凸起,颜色为灰黑色或黑色且有光泽,菌落直径为2~3 mm,常有浅色或非白色边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带,用接种针接触菌落时会有黄油样黏稠感。

1.5.3 菌落计数与确认

选择呈现典型金黄色葡萄球菌特征且同一稀释度菌落数合计在20~200 CFU的平板,从中选取12个可疑或典型菌落,分别进行革兰氏染色镜检、血浆凝固酶试验及血平板划线,于36 ℃培养箱中培养24 h。

2 鉴定结果

如表1所示,经菌落计数器观察,在3个稀释度中,符合菌落计数要求的为10-2稀释度。

2.1 革兰氏染色

从Baird-Parker平板上挑取4个可疑菌落经革兰氏染色鉴定,仅可疑菌落1为典型金黄色葡萄球菌菌落,如表2所示。

2.2 血浆凝固酶试验

选取6个典型金黄色葡萄球菌菌落(与可疑菌落1类似的菌落),将其中5个菌落分别接种至5 mL BHI中,1个菌落划线接种至营养琼脂小斜面,同时挑取表皮葡萄球菌[CMCC(B)26069]与金黄色葡萄球菌(ATCC25923)菌落接种至5 mL BHI中作为阴性对照和阳性对照,在36 ℃培养箱内培养约20 h,吸取BHI培养物0.8 mL加入冻干兔血浆中,轻微摇晃至完全溶解,放置于36 ℃培养箱中培养6 h,其间每隔0.5 h观察一次,试验结果如表3所示。

2.3 血平板划线试验

选取2个与可疑菌落1类似的菌落,划线接种于血平板,于36 ℃培养箱中倒置培养24 h,观察菌落形态,结果如表4所示。菌落呈黄色湿润圆形,光滑凸起,周围有透明溶血圈。

3 分析与讨论

3.1 菌落的选取及标记

因从Baird-Parker平板上选取的4个可疑菌落为1个革兰氏阳性球菌菌落,2个革兰氏阳性杆菌菌落,1个革兰氏阳性杆菌加阳性球菌菌落。故在经验不足或难以肉眼确认典型金黄色葡萄球菌菌落时,建议在观察Baird-Parker平板的同时,将同一类型菌落做好编号(条件允许情况下,至少确认4个同一类型菌落),方便在革兰氏染色鉴定后,选取标记的菌落进行血平板及营养琼脂小斜面划线和血浆凝固酶试验。

3.2 血浆凝固酶试验注意事项

血浆凝固酶试验判定标准:在阴性和阳性对照结果均成立的情况下,样品倒置后出现凝固或凝固体积大于原体积的一半时,即判为阳性。若结果可疑,则从NA斜面上挑取菌落至5 mL BHI中,于36 ℃培养箱内培养48 h,重复试验。根据表3,可确认此样品血浆凝固试验酶结果为阴性。

金黄色葡萄球菌凝集后会发生自溶现象,故每0.5 h观察一次,且观察过程中需要注意不能剧烈摇晃瓶身(因此操作会导致凝块被振碎,影响结果的判断);致病性金黄色葡萄球菌绝大多数为血浆凝固酶阳性,故我国食品微生物检测以血浆凝固酶阳性作为金黄色葡萄球菌的主要判定标准,以革兰氏染色和溶血试验结果作为辅助判定标准[6-7]。

3.3 血平板结果确认

从表4可知,样品在血平板上呈现明显金黄色葡萄球菌菌落特征,因Baird-Parker平板上挑取的可疑菌落的革兰氏阳性杆菌检出率较高,为进一步确认检验结果,从血平板上挑取10个典型菌落再次分别进行革兰氏染色镜检和血浆凝固酶试验。试验结果显示,革兰氏染色镜检的5个菌落均为革兰氏阳性球菌,血浆凝固酶试验的5个菌落均未出现凝集现象,且阴、阳性对照成立。

3.4 总结

从此次试验来看,样品中的金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上的分离效果欠佳,在排除培养基配制不当等因素的情况下,考虑可能是Baird-Parker培养基开封时间较长,导致其金黄色葡萄球菌菌落促生长能力降低或抑制非葡萄球菌的能力降低,继而影响了分离效果。为避免此类情况的发生,建议实验室往后在开展金黄色葡萄球菌第二法检验划线Baird-Parker培养基试验的同时,增设阳性对照组,以确认培养基的有效性。若阳性对照的金黄色葡萄球菌在培养基上生长良好,分离度高,则可排除培养基的问题,考虑为样品的偶然性事件。

参考文献:

[1]李留洋.金黄色葡萄球菌检验技术介绍及分析[J].食品安全导刊,2020(16):28-31.

[2]邓锦秀.2022年食品中金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌的检测能力验证结果分析[J].食品安全导刊,2023(27):67-70.

[3]刘真真,林涛,李光伟,等.金黄色葡萄球菌不同培养与反应条件对其血浆凝固酶的影响[J].检验检疫科学,2005(5).

[4]后来旺,李达容,邓波,等.金黄色葡萄球菌RAA-LFD快速检测方法的建立与应用[J].食品科学,2022,43(4):331-339.

[5]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.国家食品药品监督管理总局食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验:GB 4789.10—2016[S].北京:中国标准出版社,2016.

[6]时威,卢勉飞,蔡芷荷,等.冻干兔血浆在金黄色葡萄球菌检验中的应用研究[J].食品与发酵科技,2012,48(6):44-47.

[7]王丽哲,晋怀峰,宫树权,等.金黄色葡萄球菌污染水产食品的研究[J].食品科学,2001(5):78-80.

(栏目编辑:李 菡)

作者简介:许志瑛(1991—),女,本科,助理工程师,研究方向:食品检验检测。

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