青稞F1真假杂种SSR标记鉴定

摘 要：属大麦变种之一的青稞是西藏特有的地区优势作物，是重要的粮食来源和饲料来源。获得真杂种是青稞杂交育种和其他遗传研究的重要基础。为建立青稞杂种鉴定的可靠方法和探明青稞种质资源遗传的多样性，试验从30对SSR分子标记中筛选，得到4对条带清晰、差异明显、多态性好的引物，后利用4对引物对10个杂交组合后代进行真假杂种鉴定。结果表明，引物Qingke5H225、Qingke2H050和Qingke2H053可对Vada×L94、Vada×YS213、L94×ZQ13、L94×ZQ3000、YS213×ZQ3000、YS213×ZQ13、YS133×YS213杂交组合的后代进行真假杂种鉴别，共有9个杂交组合获得真杂种，与形态学田间鉴定结果一致。这表明SSR分子标记适用于鉴定青稞的真假杂种，且所需时间短、效率高，可为后续青稞育种工作奠定坚实的基础。

关键词：青稞；SSR分子标记；引物；真假杂种

中图分类号：S512.3 文献标志码：B 文章编号：1674-7909（2024）18-88-4

DOI：10.19345/j.cnki.1674-7909.2024.18.020

0 引言

大麦（Hordeum vulgare L.）为禾本科大麦属一年生草本植物，是世界第四大禾谷类作物，其总产量和种植面积仅次于小麦、水稻和玉米［1］，已在世界范围内种植数千年［2］。大麦因含有丰富的膳食纤维、β-葡聚糖等成分，可作为饲料、粮食和啤酒工业原料等，受到了人们的广泛关注［3］。同时，大麦也是具有遗传研究模式的作物，因为其是二倍体遗传、存在大量的遗传多态性、有相对较少的染色体数目（2n=14）及高度自花传粉的作物。根据种子是否有稃，大麦可分为有稃型皮大麦和无稃型裸大麦［4］；相较于有稃型皮大麦，裸大麦籽粒的内外稃和颖果容易分离［5］。裸大麦也被称作青稞，属大麦变种之一，是青藏高原及其周边地区唯一大规模种植的粮食作物，也是重要的饲料来源。青稞已成为国内约50%藏族人民喜爱的食物，以青稞为原料加工生产的青稞酒、青稞茶和其他产品［6］，也是广受欢迎的绿色健康食品。除青藏高原外，在南非热带的干旱草原及晒盐池到欧洲的北寒温带，都有青稞的踪迹。我国西藏自治区、四川省甘孜藏族自治州、青海省、云南省及甘肃省甘南藏族自治州，都是以种植青稞为主。

目前，青稞育种主要采用传统育种、单倍体育种和分子标记辅助相结合的方法，以增加青稞的产量，提高青稞对多种病害的抗性。杂交育种是选育新品种的重要手段，对不同遗传背景的亲本进行杂交，可以获得具有双亲优良性状的后代。在青稞育种研究中，杂交育种被广泛应用于提高产量、增强抗逆性、改善品质等方面。青稞作为一种自花授粉植物，在其杂交育种过程中，确保杂交后代的真实性是至关重要的一步。由于自花授粉的特性，以及人工去雄过程中可能存在的不彻底问题，后代往往会出现真杂种与假杂种混杂的情况。这不仅影响了育种效率，还可能对后续的遗传改良和研究造成误导。因此，有必要鉴定杂交后代的真实性。

分子标记具有选择中性、不受环境影响和数量庞大等特性，被广泛用于大麦［7-10］、玉米［11］、小麦［12］和水稻［13］等农作物的遗传差异研究。在各种分子标记中，简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）标记具有多态性高、数量丰富和操作简单等优点［7-10］，SSR是核苷酸序列的串联排列，其中包含1～6个碱基。每个SSR位点上不同等位基因的重复单位数量具有高度的特异性，重复单位的序列不一定完全相同。微卫星多态性分析法是利用基因组中存在的大量微卫星序列，根据同一物种中微卫星序列两侧的高度序列设计引物，通过PCR扩增特异性，扩增基因组DNA中的微卫星序列；然后通过凝胶电泳测定扩增产物，观察比较扩增产物的长度变化，达到基因组DNA之间多态性分析的目的，可准确快速识别F1代的杂交种。在该试验中，通过田间形态和SSR分子标记技术结合的方法从10个青稞杂交组合中鉴定真假杂交种。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试亲本材料于2023年种植在西藏自治区农牧科学院3号试验田，2023年6—7月通过人工去雄的方法设置了多个杂交组合。同年11月获得的种子种植于温室内，出苗后选取嫩叶，-80 ℃冰箱保存。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取

采用改良CTAB法提取DNA［14-15］。①将水浴锅预热至65 ℃。②将0.2 g嫩叶置于2.0 mL离心管内，并放入研磨机研磨2 min。③在研磨好的叶片上加入CTAB提取缓冲液，在65 ℃水浴中每10 min轻微振荡1次离心管，共3次，使其与缓冲液充分接触。④加入 0.6 mL氯仿和异戊醇的混合液（氯仿与异戊醇体积比为24∶1），振荡混匀30 min。⑤在12 000 r/min转速下离心10 min，取其上清液，加入0.6 mL冰异丙醇，轻轻摇晃2 min，静置30 min，-4 ℃冰箱保存。再在12 000 r/min转速下离心10 min后，弃上清液，加1 mL 70%乙醇洗涤沉淀2次，12 000 r/min离心10 min，保留沉淀。⑥确保离心管干燥，加入无菌水0.2 mL，后水浴加热2 min，DNA保存在-20 ℃条件下。

1.2.2 PCR扩增

PCR反应体系（10 µL）：上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，2×Master Mix 5 μL，dd H2O 2 μL。

PCR扩增程序：预变性反应5 min，变性反应95 ℃、30 s，退火60 ℃、30 s，延伸72 ℃、1 min，再延伸72 ℃、10 min，最后4 ℃循环保存。PCR产物用0.8%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，用硝酸银染色，用甲醛显色后拍照存档。

1.2.3 筛选SSR标记

利用实验室30对SSR引物标记对杂交组合的亲本进行初筛，筛选出差异明显、条带清晰及多态性好的引物。

1.2.4 鉴定杂种

利用筛选出的SSR引物，对所有杂交后代进行鉴定，具有2种亲本条带的杂交种是真正的杂交种。

1.2.5 田间形态鉴定

在杂交后代的苗期和成株期进行田间性状及形态调查，记录取样编号。

2 结果与分析

2.1 SSR标记筛选父母本多态性结果

通过30对SSR引物筛选分析10个杂交组合8个亲本材料的多态性（如图1），分析得到了4对差异明显的引物（Qingke2H050、Qingke2H053、Qingke5H225、Qingke3H310），具体见表1，以鉴定杂交种。

2.2 杂种的分子鉴定

筛选出差异明显的4对引物，并用至少2对引物进行反复验证，检测每个杂交组合的植株，以确保结果的准确性。杂交种鉴定结果见表2。在10个杂交组合中，没有获得真杂种的杂交组合占10%，获得真杂种的杂交组合占90%，其中Vada×L94、Vada×YS213等7个组合杂交的成功率为100.0%。判断其是否为真杂种或假杂种，是根据植株所呈现出的扩增条带来判断的。真正的杂交种应是共显性的，有来自双亲的扩增条带（如图2），通常假杂种只有来自母本的扩增条带（即无父本的条带），这样的假杂种需要进一步观察。

2.3 田间形态学鉴定

杂交后代在出苗期和成株期的形态介于双亲形态之间，这种种间形态差异较大的杂交组合通过形态观察很容易判断真假杂交种。例如，杂交组合YS213与ZQ13的杂种后代形态与父本一致，为真杂种；杂交组合ZY865与YS213的杂种后代形态与母本一致，为假杂种。可以从株型、株高、棱叶片姿势等形态差异来进行区分。但是若杂交后代种间形态差异较小，则很难通过形态观察来鉴别真假杂种，可以利用分子标记技术来鉴定亲本间形态差异较小的杂交组合后代。

3 结论和讨论

杂交育种是培育青稞新品种的重要途径。真杂种和去雄不完全或闭花受精造成的假杂种需要通过杂种真实性鉴定来区分，因为人工去雄不彻底或在杂交过程中受外来花粉的污染，会导致产生一定比例的自交后代。形态分析是鉴定杂交种最简单、最直接的方法。一般情况下，株型、株高、叶片姿势、穗姿势等形态差异可以作为青稞田间形态鉴定的依据，但这些方法需要比较亲本与子代之间的差异，周期长，不能快速大量判断杂交后代的杂种真实性，可能会受到环境条件等外部因素的影响，导致结果产生误差。因此，可以使用SSR分子标记进行验证。试验在形态对比的基础上，从遗传学角度利用分子技术对青稞杂交组合后代中的真假杂种进行鉴定，不会受环境的影响，准确度更高，数据更加真实。SSR分子标记具有共显性，可区分杂合基因和纯合基因位点，重复性和稳定性好，技术简单，只需要使用1对SSR引物就能准确鉴定杂交后代［16-18］。

分子标记辅助育种是当前青稞育种的主要趋势。分子标记辅助育种主要包括鉴定杂交组合后代的真假杂交种、鉴定作物种质资源、构建遗传图谱、研究作物的遗传多样性及定位目的基因。在作物从野生种转变为早期驯化的遗传资源，再转变为现代栽培种的过程中［19］，其遗传变异性大大降低，导致遗传基础单一化、许多潜在有用的基因丢失［20］。栽培种、野生大麦及原始地方品种都具有丰富的遗传变异性，可以作为作物遗传改良的种质资源［21］。利用常规杂交、回交育种及分子标记等手段，可将目标基因或基因组片段引入现代育种材料中，选育出更多抗病、高产、优质的品种［22］。

试验对多个青稞杂交后代进行全生育期形态学鉴定与SSR分子标记鉴定，将形态学鉴定结果与SSR分子标记鉴定结果进行对比分析，发现两者在鉴定青稞真假杂种的结果上具有高度的一致性。这表明SSR分子标记技术能够用于青稞真假杂种的鉴定，这2种方法相互印证，提高了鉴定结果的准确性和可靠性。

4 结束语

综上所述，真假杂种的鉴定是青稞育种的重要环节，利用SSR分子标记技术鉴定青稞杂种比传统鉴定方法更具优势，对加快青稞品种选育具有重要作用。

参考文献：

［1］HUA W，ZHANG X Q，ZHU J H，et al. A study of genetic diversity of colored barley （Hordeum vulgare L.） using SSR markers［J］.Genetic Resources and Crop Evolution，2015，62（3）：395-406.

［2］BOTHMER R V. Genetic diversity for quantitatively inherited agronomic and malting quality traits［J］. Developmentn Plant Genetics and Breeding，2003（7）：201-226.

［3］栾海业，臧慧，沈会权，等.大麦白化颖壳突变体的转录组学分析［J］.核农学报，2017，31（12）：2332-2339.

［4］MATHRE D E.大麦病害概略［M］.蔺瑞明，冯晶，陈万权，等，译.2版.北京：中国农业科学技术出版社， 2013.

［5］李真.大麦粉对面团特性与面包焙烤品质的影响及其改良剂研究［D］.镇江：江苏大学，2014.

［6］吴舒颖，高纪儒，杜艳，等.青稞制品加工研究进展［J］.食品研究与开发，2021，42（21）：201-210.

［7］MATUS I A， HAYES P M. Genetic diversity in three groups of barley germplasm assessed by simple sequence repeats［J］.Genome，2002，45（6）：1095.