弥猴桃叶斑病菌的分离鉴定及室内防治药剂筛选
作者: 何炜1 文胜兰2 樊荣20 引言
猕猴桃(ActinidiachinensisPlanch.)属于落叶藤本植物,原产于我国长江中下游地区。我国是世界弼猴桃生产大国,而贵州省地处我国弼猴桃属植物最集中分布的西南地区腹地,是全国弼猴桃生产的特色优势区域1]。经过多年发展,贵州省弼猴桃种植面积已超过3.49万 ,跃居全国第三[2]。然而,由于极端天气频发和种植品种单一,弼猴桃在生产过程中常常面临着多种病害威胁,其中弼猴桃叶斑病危害最为严重,给弼猴桃产业的可持续发展带来了巨大挑战[3]。该病害导致弼猴桃叶片出现斑点或斑块,受感染的叶片易褪绿变黄、皱缩枯萎,使植株光合作用和营养吸收能力降低,造成果实产量和品质严重下降[4]。引起猕猴桃叶斑病的病原菌种类复杂,包括弼猴桃假尾孢菌、可可毛色二孢菌,以及链格孢、多主棒孢和茎点霉属等多种真菌[5]。
目前,对弼猴桃叶斑病的主要防治方法以化学药剂防治为主。因此,筛选高效、低毒、低残留的化学药剂用于弼猴桃叶斑病的防治,对保障弼猴桃产业健康可持续发展意义重大[6。研究通过组织分离法获取1株弼猴桃叶斑病菌,根据形态学观察和系统发育分析对其进行鉴定,并通过室内毒力测定,筛选有效防控该病原菌的药剂,以期为弼猴桃叶斑病的科学防控提供参考依据。
1试验材料与方法
1.1 试验材料
2023年6月,在贵州省黔东南凯里市下司镇花桥村重荫坡弼猴桃园 采集“红阳”品种具有典型叶斑病症状的病叶8片,带回贵州大学农产品质量安全实验室进行病原菌的分离纯化。
供试药剂包括 80% 戊唑醇水分散性粒剂(陕西美邦药业集团股份有限公司), 10% 苯醚甲环唑水分散性粒剂(河北兴柏农业科技股份有限公司),25% 咪鲜胺乳油(江苏辉丰生物农业股份有限公司), 70% 代森联可湿性粉剂(巴斯夫欧洲公司),25% 嘧菌酯悬浮剂(先正达南通作物保护有限公司), 70% 丙森锌可湿性粉剂(德国拜耳作物科学公司)。
1.2 研究方法
1.2.1 病原菌的分离与纯化
采用组织分离法对病原菌进行分离培养。在无菌超净台上,用无菌接种刀切取病原交界处的组织块,根据TAN等的研究方法进行分离纯化直至获得单一形态的菌落。
1.2.2 病原菌的致病性测定
参照郭睿文等8的方法,用菌块分别对健康的离体和活体弼猴桃叶片进行接种,以检测病原菌的致病性,完成柯赫氏法则检测。
1.2.3 病原菌的形态学鉴定
用接种针挑取菌落边缘的菌丝制片,通过光学显微镜(LEICADM500)观察分离菌株的菌丝和分生孢子的形态、大小、颜色等特征,并结合相关文献初步确定病原菌所属类群。
1.2.4病原菌的分子生物学鉴定
按照真菌DNA提取试剂盒(Biomiga)说明书提取病原菌基因组DNA,并用通用引物ITS、Alta1(F:5'-ATGCAGTTCACCACCATCGC-3',R:5'-ACGAGGGTGAYGTAGGCGTC-3')和GAPDH(F:5'-CAACGGCTTCGGTCGCATTG-3',R:5'-GCCAAGCAGTTGGTTGTGC-3'进行PCR扩增。由北京擎科生物科技有限公司对扩增产物进行测序。然后,将所得序列在GenBank数据库中进行比对,并利用MEGA11软件采用最大似然法(ML)构建系统发育树[10]
1.2.5 病原菌的室内毒力测定
采用菌丝生长速率法测定6种杀菌剂对病原菌的室内毒力[11]。采用十字交叉法测量菌落直径并拍照。抑制率 (%)=100%× (对照菌落扩散直径-处理菌落扩散直径)/(对照菌落平均直径-菌饼直径)。以供试药剂有效成分质量浓度( $\mathrm{\mg/L}$ 的对数值为自变量 (x) ,抑制率的概率值为因变量 (y) ,建立杀菌剂的毒力回归方程式和计算相关系数 ,并由毒力回归方程计算EC50值。
1.2.6 数据处理与分析
采用Excel2010、GraphpadPism9.5等软件对试验数据进行处理和统计分析。
2 结果与分析
2.1病原菌分离鉴定
对弼猴桃病叶进行组织分离纯化,共获得1株分离株,命名为YB7。在PDA培养基上 恒温培养6d后,发现菌株YB7菌落边缘规则,气生菌丝呈发达的白色绒毛状,菌落中心为暗褐色,边缘为灰白色(图1A和图1B)。显微镜观察结果显示,菌株YB7的分生孢子呈倒棒状、椭圆形或卵圆形,暗褐色,表面具横隔或纵隔,呈壁砖状结构,横隔较粗,末端喙短,孢子大小为(17.715\~69.373) $\upmu\mathrm{m}\times$ (10.042~43.118 ) $\upmu\mathrm{m}$ (图1C)。菌丝及分生孢子梗至暗褐色,具横隔(图1D)。根据上述形态特征,将YB7初步归类于链格孢属真菌。

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注:菌株YB7在PDA培养基上 恒温培养6d的菌落正面(A)和反面(B),YB7菌株的分生孢子(C),YB7菌株的菌丝和分生孢子梗(D),标尺为 ${50\upmu\mathrm{m}}$ 。
将YB7菌株的ITS、AIta1和GADPH序列串联,以StemphyliumcallistephiEEB1055为外群构建系统发育树。结果表明,菌株YB7与Alternariaalter-nataCBS109455聚于一支,支持率为 97% (图2)。因此,综合形态学观察和系统发育分析结果,将菌株YB7鉴定为交互链格孢菌。
2.2 病原菌致病性测定
将YB7菌块接种至离体的健康弼猴桃叶片4d后,其可引起叶片正面(图3B)与背面(图3D)出现圆形规则的黑褐色病斑,症状与果园弼猴桃叶斑病症状(图3A)一致。将YB7菌块接种到盆栽弼猴桃的健康叶片上6d后,也可在接种部位观察到黑褐色规则病斑(图3C),而只接种PDA培养基的空白对照未发病。这表明菌株YB7是弼猴桃叶斑病的病原菌。


注:A一果园自然发病叶片;B一离体叶片接菌正面发病症状(第4天);C—盆栽猕猴桃人工接菌发病症状(第6天);D一离体叶片接菌反面发病症状(第4天)。其中白色和黑色箭头分别代表PDA空白对照接种部位和菌株YB7菌块接种部位。
2.36种杀菌剂对YB7的室内毒力测定
如表1所示,通过构建毒力回归方程发现, 25% 咪鲜胺乳油对YB7菌株的室内毒力最强,其EC50值为 0.05mg/L 10% 苯醚甲环唑水分散性粒剂的EC50值为 ,对YB7菌株也具有较好的抑菌作用;其次是 80% 戊唑醇水分散性粒剂和 70% 丙森锌可湿性粉剂,其EC50值分别为 2.81mg/L 和8.39mg/L 25% 嘧菌酯乳油和 70% 代森联可湿性粉剂对交互链格孢菌的抑菌效果相对较差,EC50值分别为 22.29mg/L 和 23.36mg/L 。综上所述, 25% 咪鲜胺乳油和 10% 苯醚甲环唑水分散性粒剂的抑菌效果最明显,是理想的药剂选择,其他药剂作用次之。
3结束语
研究通过组织分离法,并结合形态学特征和多基因联合分析,明确了引起贵州省黔东南州凯里市下司镇花桥村弼猴桃园叶斑病的病原菌为交互链格孢菌。链格孢属真菌是一类具有较强适应性的常见暗色真菌,能引起苹果霉心病、梨黑斑病、甜樱桃黑斑病等病害,给高经济价值的果树产业生产造成了严重的产量和经济损失[12]。且每年6—7月贵州省降雨量较大,气候潮湿,加速了弼猴桃叶斑病的发生。

化学防治具有快速高效、机械化操作和使用方便等特点,是病害防治的首选手段,但是在化学防治中盲目用药会导致污染环境。因此,高效杀菌剂的筛选对于防控农业病害精准用药具有重要意义。其中戊唑醇、苯醚甲环唑、咪鲜胺、代森联、嘧菌酯、丙森锌均属于高效、广谱性杀菌剂,并且对链格孢属真菌均具有较好的抑菌效果。研究表明,70% 的丙森锌对柑橘链格孢菌抑菌效果最好,EC50值为 $0.2475~\upmu\mathrm{g/mL}^{[13]}$ ;梨黑斑病链格孢菌对咪鲜胺、苯醚甲环唑的敏感性较高,EC50值为 ;嘧菌酯对芍药黑斑病链格孢属真菌交互链格孢菌的菌丝抑制作用明显[15];2g/L43% 的戊唑醇对苹果叶斑病链格孢真菌菌丝的生长有较强的抑制作用,抑菌率达
;杀菌剂代森联对草莓链格孢属真菌病害相对防效最好[7]。然而,关于弼猴桃叶斑病菌交互链格孢菌防治药剂的研究相对较少,为避免盲目使用化学药剂,研究选取了6种杀菌剂,分别为 25% 咪鲜胺乳油、 10% 苯醚甲环唑水分散性粒剂、 80% 戊唑醇水分散性粒剂 .70% 丙森锌可湿性粉剂 25% 嘧菌酯悬浮剂和 70% 代森联可湿性粉剂,进行室内毒力测定,并明确了 25% 咪鲜胺乳油和 10% 苯醚甲环唑水分散性粒剂对交互链格孢菌具有较好的抑菌作用。结果将有助于为交互链格孢菌引起的弼猴桃叶斑病的科学防治提供参考依据。
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