一株黄颡鱼源嗜水气单胞菌的分离、鉴定及特性分析

［摘 要］ 广西壮族自治区百色市田东县某黄颡鱼养殖场出现暴发性疾病，患病鱼呈现腹部肿大、腹腔积水、肛门红肿等症状。为查明此次疾病发生原因，从患病鱼的肝脏、肾脏、脾脏等组织进行病原菌分离，通过生化特性、分子生物学方法对病菌进行分类鉴定，并进一步研究分离菌株的药物敏感性和致病性。结果显示，从患病鱼体内分离出一株嗜水气单胞菌，对黄颡鱼具有较强的致病性。药敏试验结果表明，分离菌株对氨曲南、头孢唑啉、氧氟沙星等13种抗生素敏感，对链霉素、妥布霉素中介，对氨苄西林高度耐药。

［关键词］ 黄颡鱼；嗜水气单胞菌；分离鉴定

［中图分类号］ S943 ［文献标志码］ B ［文章编号］ 1674-7909（2022）11--4

0 引言

黄颡鱼，俗称黄蜂鱼、黄鼓鱼、黄角丁等，隶属于鲇形目鲿科黄颡鱼属小型底层经济鱼类，主要分布于河道、湖泊、水库等静水或缓流水域。其因具有含肉率高、肌肉粗脂肪含量适宜、肉质鲜嫩细腻、富含多种人体必需氨基酸等优点而深受人们喜爱［1］。2018年，黄颡鱼在我国淡水养殖鱼类中占比已达1.65%，产量为48万t［2］。近年来，随着养殖规模的持续扩大和养殖密度的不断增加，黄颡鱼病害形势日趋严峻。其中，嗜水气单胞菌［3］、维氏气单胞菌［4］、铜绿假单胞菌［5］等致病菌频繁引起的黄颡鱼细菌性疾病暴发尤为显著，给养殖户造成巨大经济损失的同时，严重制约了黄颡鱼养殖产业健康发展。

2021年8月，广西壮族自治区百色市田东县某黄颡鱼养殖场出现暴发性疾病，患病鱼呈现腹部肿大、腹腔积水、肛门红肿等症状。笔者从患病黄颡鱼的肝脏、肾脏、脾脏组织中分离到一株优势菌，对分离菌株进行综合鉴定，并对该菌株致病性和药物敏感性进行系统分析，旨在为该病的科学防治提供数据支撑和理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

患病黄颡鱼取自田东县某黄颡鱼养殖场。人工感染试验用健康黄颡鱼购自田东县农贸市场，规格为12～15 cm，实验室暂养3～5 d无发病死亡现象。血琼脂培养基、微生物微量生化鉴定管购自广东环凯生物科技有限公司，脑心浸液培养基（BHI）购自北京陆桥技术有限责任公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、2×Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 病原菌分离与纯化

将无菌接种针刺入但不穿透发病黄颡鱼的肝脏、肾脏、脾脏组织，划线接种于血琼脂培养基，置于30 ℃恒温箱中培养24 h；用无菌接种针挑取单菌落于血琼脂培养基上做纯培养。

1.3 形态学观察

将纯化后的菌株于血琼脂培养基上进行划线接种，置于30 ℃恒温箱中培养24 h，观察单菌落形态学特征和菌落周边溶血环特征。挑取单个菌落进行革兰氏染色，置于显微镜下观察革兰氏染色结果和菌体形态特征。

1.4 生化特性分析

对分离菌株的代表性生化特性使用微生物微量生化鉴定管进行测定，比照《常见细菌系统鉴定手册》［6］106-119中相应细菌生化特性指标初步鉴定分离菌株。

1.5 分子生物学鉴定

将分离菌株接种于BHI液体培养基中，30 ℃下恒温培养24 h。PCR模板使用新鲜菌液经离心去除培养基后所剩菌体，用细菌通用性引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）［7］对分离菌的16S rDNA进行扩增。采用50 μL反应体系：PCR预混酶（2×Taq PCR Master Mix，含DNA聚合酶、dNTP与缓冲液）25 μL，引物（10 μmol/L）各2 μL，双蒸水 19 μL，DNA模板2 μL。扩增反应程序为预变性温度94 ℃，预变性时间5 min；变性温度94 ℃，变性时间30 s，退火温度55 ℃，退火时间30 s，延展温度72 ℃，延展时间1 min，循环次数30次；稳定温度72 ℃，稳定时间10 min。使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化回收，由上海立菲生物技术公司测序，Blast分析测序结果与NCBI数据库中现有核酸序列同源程度，采用Neighbor-Joining法使用MEGA 7.0软件构建系统进化树。

1.6 药物敏感试验

取100 μL纯化培养24 h后的新鲜菌液，于血琼脂平板上均匀涂布，待血琼脂培养基表面基本干燥后，将药敏纸片分别粘贴于血琼脂培养基上，倒置于30 ℃恒温箱中培养24 h。观察抑菌圈的形成情况并用游标卡尺测量抑菌圈直径，根据抑菌圈直径与药物敏感性间的相互关系［8］，确定分离菌株对各药敏纸片所对应药物的敏感程度。

1.7 人工感染试验

将分离菌株接种在BHI液体培养基中，置于30 ℃恒温培养箱中培养24 h，12 000 r/min离心2 min沉淀菌体，去上清液，用0.85%无菌生理盐水洗涤收集，采用麦氏比浊法和梯度稀释法制备成1×109、1×108、1×107、1×106 CFU/mL的菌悬液。将健康黄颡鱼分为4个感染组和1个阴性对照组，每组30尾。分别用4种不同浓度的菌液对4个感染组进行腹腔注射，每尾黄颡鱼从腹鳍基部等量注射0.1 mL，用无菌生理盐水（0.85%）对对照组黄颡鱼每尾等量注射0.1 mL。期间常规饲养管理，对7 d内各组黄颡鱼的死亡情况及时进行观察、记录，并立即解剖死亡鱼，从肝脏、肾脏、脾脏组织中再次进行菌株分离与鉴定。

2 结果与分析

2.1 菌株形态

将采取到的菌株命名为TDX07，其在血琼脂培养基上生长良好，菌落周围有明显的β溶血环，形态为圆形、乳白色、不透明、有光泽、中间凸起及边缘光滑。培养24 h后，菌落直径1.5～2.3 mm。革兰氏染色呈阴性，短杆菌，长度1～2 μm，多数呈单个或分散排列，少数成对或呈短链状排列（见图1）。

2.2 生化特性测定

菌株TDX07的生理生化特性测定结果与《常见细菌系统鉴定手册》［6］364-398中嗜水气单胞菌标准株的特性一致（见表1）。

2.3 分子生物学鉴定

菌株TDX07的16S rDNA序列PCR扩增产物测序结果为1 537 bp。BLAST分析显示，其与嗜水气单胞菌的16S rDNA序列（GenBank登录号：M59148.1和NR07484.1）具有高度同源性。系统进化树如图2所示，菌株TDX07与嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）聚为一类。

2.4 人工感染试验

如表2所示，菌株浓度1×109 CFU/mL感染组，黄颡鱼急性快速死亡，1 d死亡率100.0%；菌株浓度1×108 CFU/mL感染组，黄颡鱼第1天开始死亡，

7 d死亡率90.0%；菌株浓度1×107 CFU/mL感染组，黄颡鱼第1天开始死亡，7 d死亡率53.3%；菌株浓度1×106 CFU/mL感染组，黄颡鱼第2天开始死亡，7 d死亡率33.3%；对照组黄颡鱼无死亡现象。多数濒死黄颡鱼表现出腹部肿大、腹腔积水、肛门红肿、肠道充血、运动失衡及行动迟缓等症状，与自然条件下发病黄颡鱼症状相同。从濒死黄颡鱼内脏组织中分离纯化出的细菌性状与TDX07一致，经鉴定同为嗜水气单胞菌。

2.5 药物敏感试验

如表3所示，菌株TDX07对氨曲南、头孢唑啉、氧氟沙星等13种药物敏感，对链霉素、妥布霉素中介，对氨苄西林耐药。

3 讨论

菌株TDX07的生化特性与《常见细菌系统鉴定手册》［6］364-398中嗜水气单胞菌标准株的生化特性一致。经分子生物学分析，菌株TDX07的16S rDNA序列高度同源于美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）数据库中嗜水气单胞菌的16S rDNA序列。据此，鉴定TDX07为嗜水气单胞菌。人工感染试验证实TDX07对黄颡鱼具有致病性，且菌液浓度越高致病性越强。由此确定，该研究中黄颡鱼暴发性疾病的病原菌为嗜水气单胞菌。

嗜水气单胞菌可以产生肠毒素、溶血素、坏死毒素等多种外毒素，除黄颡鱼外，还可感染黑天鹅［9］、大羚羊［10］等多种动物，甚至可以感染人类，是典型的鱼、禽、畜、人共患病病原菌。因此，养殖户在养殖过程中应加强嗜水气单胞菌防控工作。如发现患病黄颡鱼，要立即采用隔离、掩埋等方式进行无害化处理，防止传染给同水域健康黄颡鱼或周边家禽、家畜，更应避免流入销售市场。

药物敏感试验结果显示，嗜水气单胞菌对氨苄西林高度耐药性。这是因为气单胞菌属细菌会产生β-内酰胺酶。氨苄西林属于β-内酰胺类抗生素，β-内酰胺酶可使β-内酰胺类抗生素失去活性［11］，造成嗜水气单胞菌对氨苄西林具有天然耐药性。因此，对于嗜水气单胞菌感染引起的各类疾病，均应避免使用此类药物。

近年来，面对黄颡鱼细菌性疾病，养殖户往往盲目使用多种抗生素应对。这种做法易造成黄颡鱼养殖水体及周边环境中药物敏感菌株被持续消灭，进而可能导致由于基因突变等原因形成的耐药菌株乃至多重耐药菌株出现并快速增殖。如果此种致病菌感染黄颡鱼，将难以使用常规药物治愈，甚至有可能出现无药可医的情况。因此，养殖户面对黄颡鱼细菌性疾病时，应第一时间进行药物敏感试验，并根据试验结果合理选用病原菌敏感性强的药物进行治疗，同时严格控制药物用量，杜绝过量用药。

参考文献：

［1］韩庆，马欣欣，黄春红.洞庭湖黄颡鱼肌肉营养成分及品质特性分析［J］.食品安全质量检测学报，2021（23）：9102-9108.

［2］代云云，袁永明，袁媛，等.我国黄颡鱼产业生产现状与发展趋势分析［J］.现代商贸工业，2019（23）：23-24.

［3］孙浩然，王丽，杨洋，等.患腹水病黄颡鱼嗜水气单胞菌的分离、鉴定及特性分析［J］.武汉轻工大学学报，2021（5）：1-8.

［4］温周瑞，许钦涵，卢伶俐，等.黄颡鱼暴发性疾病病因分析及防治措施［J］.湖北农业科学，2021（20）：119-124.

［5］阎华，王会，汤尚文，等.黄颡鱼源铜绿假单胞菌PA-5的分离及其对寄主抗菌肽基因的影响［J］.西南农业学报，2021（6）：1351-1358.

［6］东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：科学出版社，2001：106-119，364-398.

［7］HONGOH Y，YUZAWA H，OHKUMA M，et al. Evaluation of primers and PCR conditions for the analysis of 16S rRNA genes from a natural environment［J］.FEMS microbiology letters，2003（2）：299-304.

［8］黄钧，黄艳华，胡大胜，等.黄沙鳖白底板病病原菌的分离鉴定及6种毒力基因检测［J］.水生生物学报，2013（5）：844-854.

［9］单云芳，钟震宇，李俊芳.黑天鹅嗜水气单胞菌与肠致病性大肠埃希菌混合感染的诊断［J］.野生动物学报，2021（1）：245-248.

［10］刘真超.一例大羚羊感染嗜水气单胞菌的诊断［J］.农业灾害研究，2020（1）：22-23.

［11］OKUMURA K，SHOJI F，YOSHIDA M，et al. Severe sepsis caused by Aeromonas hydrophila in a patient using tocilizumab：a case report［J］.Journal of medical case reports，2011（5）：499-501.