陕北地区玉米内生细菌多样性分析

［摘 要］ 植物内生细菌生活在植物各组织器官内部，作为植物生态系统中天然的重要组成部分，其自身及次级代谢产物对寄主植物的生长发育具有重要作用。玉米作为我国重要的农作物，种植区域广泛、市场需求量大，研究玉米内生细菌多样性对于陕北地区玉米培育和生产意义重大。以新鲜玉米种子为试验材料，分离纯化内生细菌菌株，将分离出的菌株序列经过比对进行多样性分析。试验得到了唐菖蒲伯克霍尔德菌、芽孢杆菌、植生拉乌尔菌、克雷伯氏菌、变栖克雷伯氏菌、水生拉恩氏菌、肺炎克雷伯菌、蔬菜嗜油芽孢杆菌、成团泛菌及耶尔森菌共7属10株菌株。

［关键词］ 玉米内生菌；种群多样性；陕北地区

［中图分类号］ S435.131 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1674-7909（2022）16--3

0 引言

玉米又称苞米、苞谷，是全世界范围内种植广泛的农作物之一，迄今已有5 000 a栽培历史。玉米在我国粮食、工业及药用等方面有重要的应用价值。因此，玉米产量及品质对我国国民经济发展影响重大。

陕北地区地处黄土高原，平均海拔1 200 m，属中温带干旱大陆性季风气候，特点是日照充足且四季分明。近年来，陕北地区主要推广的玉米品种有登海9号、陕单609等，产量高、抗寒性好、穗大［1］。玉米生长过程中的主要病害有大斑病、粗缩病、褐斑病等，这些病害蔓延速度较快，若防控不及时，将会严重影响玉米产量［2］。玉米病害防治过程中会用到大量的化学药剂，极易造成农药残留，对土壤和环境造成污染。植物内生细菌在植物体内与其共同经历了长期的生物进化，形成了一种稳定的、互利的关系：内生菌株在植物体内生长繁殖，同时为植物生长提供诸多有益代谢产物。可有效防治植物病害的内生细菌，被称为生防菌；植物利用生防菌可以很好地抵御病害，从而避免或减少化学药剂的使用。

目前，研究人员在植物中发现的内生细菌多达120种［3］。已发现的内生细菌主要为假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、肠杆菌属（Enterobacter）、泛菌属（Pantoea）及甲基杆菌属（Methylobacterium）细菌等。玉米的内生细菌种类繁多，且在玉米的种子、根、茎、叶中均有发现。在玉米根系中发现的内生细菌主要有芽孢杆菌属（Bacillus）、土壤杆菌属（Agrobacterium）、拟诺卡菌属（Nocardiopsis）、乳球菌属（Lactococcus）和贪噬菌属（Variovorax）细菌等［4-5］。从玉米茎、叶中分离得到的内生细菌有泛菌属（Pantoea）、短小杆菌属（Curtobacterium）、黄杆菌属（Flavobacterium）、和节杆菌属（Arthrobacter）细菌等［6］。

植物内生细菌是植物内部的重要组成部分，不仅包括与植物存在互惠关系的共生菌株，同时包括与植物相互作用、相互影响的内生细菌。玉米的内生细菌具有包括促生长［7］、固氮、增强植物抗逆性等多种不同的生物学功能，掌握其作用机制，有利于更好地开发利用有益内生细菌。

1 材料与方法

1.1 玉米内生细菌的收集

在田间采集不同品种的新鲜玉米，取玉米种子作为材料，进行内生细菌的分离。其中，玉米品种有中榆1号、中榆9号、陕单662、西农2580、壳盛501、陕单652及延科9号。先从经过表面消毒的新鲜玉米种子中筛选内生细菌［7］，然后用LB固体培养基培养菌株，再挑取形状、大小、颜色有差异的单菌落进行培养，分离纯化菌株。

1.2 玉米内生菌DNA提取

先将分离出的内生细菌菌株分别接种于LB液体培养基中，37 ℃条件下，160 r/min振荡培养36 h后12 000 r/min离心收集菌体，使用DNA试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）提取各菌株DNA。然后，配制1%琼脂糖凝胶，在110 V电压下电泳35 min，使用凝胶成像分析系统检测DNA。

1.3 细菌16SrDNA PCR序列扩增

使用细菌16SrDNA基因的通用引物对细菌内生细菌的16SrDNA进行扩增。将上述提取的内生菌株DNA作为模板进行PCR扩增反应。采用25 μL PCR扩增体系：DNA模板2 μL，引物27f 1 μL，引物1492r1 μL，2×Power Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O补足至25 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存产物。PCR扩增产物用1% Agar凝胶电泳检测。将PCR扩增后的产物送至西北大学太白校区国家微生物检测中心进行测序工作，将测序结果与Genbank中的已知序列进行比对。

1.4 内生菌系统发育树分析

将上述测序结果和比对结果整理在一起，利用MEGA7.0软件［8］，以NJ法构建系统发育树，bootstrap设定值为1 000，对各菌株进行系统的进化关系分析。

2 结果与分析

2.1 玉米内生细菌的多样性

通过分离纯化培养，共筛选出玉米内生细菌10株，菌株提取的DNA凝胶电泳和PCR扩增产物的凝胶电泳检测结果显示，10株菌株的DNA条带清晰可见且均一明亮，且主要集中在1 500 bp左右，与预期吻合。将测序结果比对后发现，10株内生菌分别为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli）、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、植生拉乌尔菌（Raoultella planticola）、克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）、变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）、水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、蔬菜芽孢杆菌（Bacillus oleronius）、成团泛菌（Pantoea agglomerans）和耶尔森菌（Yersinia sp.），共7属10种。

2.2 玉米内生细菌的系统发育树分析

结合细菌形态特征及16SrDNA基因序列比对，10株玉米内生细菌分布于7属，多样性丰富。其中，克雷伯氏（Klebsiella）为优势属，3株菌株属于该属，2株菌株属芽孢杆菌属（Bacillus sp.）（见图1）。

3 结论与讨论

目前，相关学者对玉米内生细菌的研究较多且较深入，如刘娟［9］对鲜食玉米内生细菌的分离鉴定及功能进行了研究等，高增贵等［10］对玉米纹枯病拮抗内生细菌的筛选进行了研究，但对玉米种子内生细菌的具体研究报道较少［11-12］。玉米种子是玉米种植业经济效益的重要来源。因此，笔者以陕北地区玉米种子为研究材料，分离培养其中的内细生细菌，以期推动对玉米种子内生菌多样性的研究。

笔者采用组织表面消毒法对玉米种子进行预处理，然后分离、培养玉米种子内的内生细菌，并提取菌株DNA，利用细菌16SrRNA引物进行PCR扩增，最后对PCR扩增得到的序列进行测序。根据测序结果，对得到的10株内生细菌进行系统发育树分析。结果发现，10株菌株分属于7个菌属。Eb03代表的克隆序列与水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）聚为一类，同源性最高。孙孝文等［13］的研究表明，水生拉恩氏菌可以高效解磷，对植物真菌性病害能够起到防治作用。这是一种兼性细菌，既可在土壤等环境中生存，也可作为内生菌生存在植物体内。

分离筛选陕北地区玉米植株的内生细菌，可以获得具有研究和应用价值的内生细菌资源，加深对陕北地区玉米内生细菌生态学特征的了解，明确陕北地区玉米与其内生细菌多样性关系，因此，具有不可忽视的科学价值。同时，在陕北地区玉米育种过程中合理利用内生细菌，将积极推动当地的玉米生产。

参考文献：

［1］王小燕.陕北玉米栽培技术［J］.农民致富之友，2014（22）：212.

［2］王饶生.北方玉米主要病虫害及防治技术［J］.农业开发与装备，2020（10）：205-206.

［3］杨福珍，武纤雨，张如养，等.玉米内生细菌资源研究进展［J］.生物资源，2019（5）：390-396.

［4］浦绍占，马永凯，刘敏，等.玉溪地区自然陈化烟叶表面可培养细菌多样性研究［J］.中国微生态学杂志，2016（8）：920-925.

［5］李南南，刘洋，赵燃，等.北京优质杂交玉米种子内生细菌种类多样性［J］.食品科学技术学报，2016（5）：55-63.

［6］MOWAFY A M，FAWZY M M，GEBREIL A，et al. Endophytic and enhance the growth and yield of maize［J］.Acta Agriculturae Scandinavica，Section B - Soil & Plant Science，2021（4）：237-246.

［7］杜晓宁.宁夏枸杞可培养内生菌的多样性及其生物活性研究［D］.银川：宁夏大学，2016：11-25.

［8］刘洋，左山，邹媛媛，等.杂交玉米农大108及其亲本种子内生细菌群落的多样性［J］.中国农业科学，2011（23）：4763-4771.

［9］刘娟.鲜食玉米内生菌的分离、鉴定及功能分析［D］.广州：仲恺农业工程学院，2018：18-55.

［10］高增贵，陈捷，冯晶，等.玉米纹枯病拮抗内生细菌的筛选［J］.植物保护学报，2005（4）：357-361.

［11］宋瑞琦，南铁贵，杨健，等.内生细菌资源及其次级代谢产物研究进展［J］.中国实验方剂学杂志，2020（19）：1-9.

［12］刘丽平，宋瑞凤，张馥，等.高秆野生稻内生固氮细菌多样性［J］.生物多样性，2020（8）：1018-1025.

［13］孙孝文，马卫，王慧敏.一株高效溶磷且抑真菌的水生拉恩氏菌MEM40筛选鉴定及其水稻促生研究［J］.农村实用技术，2020（10）：80-82.