拥挤胁迫对银鲳幼鱼生长及消化酶活性的影响

摘 要：为探究不同养殖密度对银鲳（Pampus argenteus）幼鱼生长及消化酶活性的影响，将平均初始体质量为3.88±0.72 g的银鲳幼鱼分别在30、60 ind/m3和90 ind/m3的密度条件下饲养40 d，测定幼鱼四种消化酶的时空变化，并比较了40 d后幼鱼的生长特性。结果表明：（1）中密度组幼鱼的增重率与特定生长率分别为（235.19±10.23）%和（4.03±0.10）%，显著高于低密度组（P<0.05），而与高密度组无显著差异（P>0.05）。饲养20 d后低、高密度组增重幅度均低于中密度组。（2）40 d后，低密度组幼鱼胰蛋白酶活性下降到了116.32 U/mg，仅为初始水平的36.7 %。但胃蛋白酶的活性显著升高，达到18.65 U/mg，是初始水平的2.5倍，显著高于其他两组；中密度组的胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶活性在40 d后均出现一定程度的下降；高密度组银鲳消化酶活性受到了明显的胁迫影响，养殖过程中出现了明显的波动变化。综上所述，过高的养殖密度会对银鲳产生胁迫作用，影响银鲳消化酶活性；过低的养殖密度也会对银鲳的生长产生不利影响。

关键词：银鲳（Pampus argenteus）；拥挤胁迫；特定生长率；增重率；消化酶

银鲳（Pampus argenteus）隶属于鲈形目（Perciformes），鲳科（Stromateidae），鲳属（Pampus），属暖水性中上层集群性经济鱼类。主要分布于中国、日本等亚洲海域，科威特、伊拉克海域的阿拉伯湾及印度孟加拉湾等印度洋和西太平洋［1］。但是近20年来，由于过度捕捞以及海洋环境的污染，使银鲳的野生资源受到了极大的破坏，其野生资源量日渐减少。为保护银鲳的种质资源，国内外学者对银鲳的人工繁育、养殖进行了诸多研究［2-6］。

随着银鲳人工育苗、养殖等一系列技术的突破，银鲳已成功实现人工养殖并逐步走向规模化养殖。养殖密度是决定养殖鱼类生长速度、产量和效益的主要因素之一，在大规模的集约化生产中往往通过增加养殖密度的方式来增加单位面积产量。然而，高密度的养殖会引起残饵和代谢废物的增加，导致水质恶化、水中有害物质含量增加等现象，这将对鱼类产生拥挤胁迫，常表现为鱼类对饲料的利用率降低、生长发育迟缓、免疫力降低等。高密度的养殖在带来较高经济效益的同时往往也增加了风险［7-10］。近年来，关于拥挤胁迫对鱼类生理与生长影响的报道较少，大多集中在饥饿、温度、盐度等方面［11-15］。消化酶作为动物体内的重要酶类，其活性的高低除反映动物消化能力的强弱外，还可以直接或间接地影响着鱼类的生长［16］。乔玮等［17］在进行大菱鲆（Scophthalmus maximus）密度养殖试验时发现，饲养密度对大菱鲆的消化酶活性有着显著的影响，高密度饲养产生的拥挤胁迫抑制了大菱鲆的生长，使得高密度组的大菱鲆增重率和特定生长率显著低于中、低两个密度组。邓超准［18］在研究拥挤胁迫对星洲红鱼的影响时也同样发现，过高的饲养密度对其消化酶及生长性能有着显著影响。

因此，为探究不同密度下银鲳生长性能及消化酶活性的变化，本试验设置了3个密度梯度组（30、60 ind/m3和90 ind/m3），测定分析不同密度下银鲳肠、胃组织中的淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶活性的时空变化，从酶活性角度分析不同养殖密度对银鲳产生的胁迫影响；同时，测定不同密度条件下40 d后银鲳的特定生长率和增重率，分析不同密度对银鲳生长的影响。试验结果将作为优化银鲳幼鱼养殖密度的指标，为大规模养殖银鲳提供理论参考，提高养殖整体经济效益。

1 材料与方法

1.1 试验用鱼

试验在宁波大学梅山校区中试基地银鲳养殖中心进行，试验用鱼为人工培育的银鲳幼鱼，养殖密度为20 ind/m3。从同一池中选取健康活泼、同一批次培育的大小规格相近的个体810尾，平均体质量3.88±0.72 g。

1.2 试验设计

采用有效水体1 m3的PVC圆桶进行试验，试验分成3个密度处理组，分别为低密度组（30 ind/m3）、中密度组（60 ind/m3）、高密度组（90 ind/m3），每组三个平行。试验周期为40 d，试验期间连续充气，避光养殖，对三个密度组的水质进行调控，尽量使水质保持一致。所选用的饲料为自制的黏性团状饲料（日本产“鱼宝”牌饲料+新鲜鱼肉糜+海蜇的混合料），置于水中间的饵料台内。为保证营养不溶失，每隔2～3 h更换饲料。海水盐度24‰～26‰，pH值为7.9～8.1，水温（28±1）℃，溶解氧（DO）含量>7 mg·L-1。

1.3 样品采集及保存办法

在试验开始后的第0、5、10、20 d和40 d分别进行取样。取大小相近，活力较好，健康的幼鱼进行试验，每次每个处理组各取6尾（每个平行取2尾），取样后及时减少桶内水体积，以保持相应的密度。将取出的活鱼立即用MS-222麻醉，分别称量体质量和体长并记录，然后将鱼置于冰盘上快速解剖，取部分肠、胃置于-80 ℃冷冻保存。

1.4 测定方法

1.4.1 生长指标计算

增重率（WG， 单位： %）和特定生长率（SGR， 单位： %）计算公式如下：

WG=100×（mt-m0）/m0      （1）

SGR=100×（lnmt-lnm0）/t（2）

式中：m0为试验开始时试验鱼的初始平均体质量，g；mt为结束时试验鱼的初始平均体质量， g；t为试验天数，d。

1.4.2 蛋白浓度的测定-BCA法 采用南京建成生物工程研究所生产的总蛋白定量测定试剂盒，组织中蛋白浓度采用BCA法测定，将20 μL待测液加入样品孔，再加入200 μL BCA工作液，37 ℃恒温箱保温20～30 min，用分光光度计在562 nm波长下测定各孔吸光值。

1.4.3 银鲳胃组织中胃蛋白酶酶活性的测定

准确称取组织重量，按重量（g）∶体积（mL）为1∶9的比例加入9倍体积的匀浆介质，然后用研磨棒在冰水浴条件下机械匀浆，制成10 %的匀浆。将离心机预冷，用离心机在2 500转/min下离心10 min，离心完成后取其上清液进行测定。酶活力测定采用南京建成生物工程研究所生产的胃蛋白酶测定试剂盒，依次添加试剂，最终在室温下用紫外分光光度计在660 nm处测量吸光度。胃蛋白酶酶活力定义：每毫克组织蛋白在37 ℃条件下每分钟分解蛋白质生成1 μg氨基酸相当于1个酶活力单位。

计算公式：胃蛋白酶活力（U/mg）=（测定管OD值-对照管OD值）/（标准管OD值-空白管OD 值）×标准品浓度（50 μg/mL）/反应时间（10 min）×反应液总体积（0.64 mL）/取样量（0.04 mL）/待测样本蛋白浓度（mg/mL）。

1.4.4 银鲳胰脏组织中胰蛋白酶活性的测定

准确称取组织重量，按重量（g）∶体积（mL）为1∶9的比例加入9倍体积的匀浆介质，然后用研磨棒在冰水浴条件下机械匀浆，制成10 %的组织匀浆，将离心机预冷，用离心机在2 500转/min下离心10 min，离心完成后取其上清液进行测定。酶活力测定采用南京建成生物工程研究所生产的胰蛋白酶测定试剂盒，将0.015 mL待测样品和1.5 mL胰蛋白酶底物应用液快速混匀，室温下用紫外分光光度计在253 nm处测量吸光度。胰蛋白酶酶活力定义：在pH值为8.0，温度为37 ℃条件下，每毫克蛋白质中含有的胰蛋白酶每分钟使吸光度变化0.003即为一个酶活力单位。

计算公式：胰蛋白酶活性（U/mg）=[（测定管A2-测定管A1）-（空白管A2-空白管A1）]/20 min/0.003×反应液总体积（1.5 mL+0.015 mL）/样本取样量（0.015 mL）/[样本中蛋白浓度（mg/mL）×样本取样量（0.015 mL）]。

1.4.5 淀粉酶活力的测定

准确称取组织重量，按重量（g）∶体积（mL）为1∶9的比例加入9倍体积的匀浆介质，然后用研磨棒在冰水浴条件下机械匀浆，制成10 %的组织匀浆，将离心机预冷，用离心机在2 500转/min下离心10 min，离心完成后取其上清液进行测定。酶活力测定采用南京建成生物工程研究所生产的α-淀粉酶（AMS）测试盒，将0.5 mL底物缓冲液和0.1 mL待测样品混合，之后依次加入碘应用液和双蒸水，室温下用酶标仪在660 nm处测量吸光度。淀粉酶酶活力定义：组织中每毫克蛋白质在37 ℃条件下与底物作用30 min，水解10 mg淀粉定义为1个淀粉酶活力单位。

计算公式：淀粉酶活力（U/mg）=（空白管OD值-测定管OD值）/空白OD值×0.4×0.5/10×30 min/7.5 min/[取样量（0.1 mL）×待测样本蛋白浓度（mg/mL）。

1.4.6 脂肪酶活性的测定 准确称取组织重量，按重量（g）∶体积（mL）为1∶4的比例加入4倍体积的生理盐水（自配），然后用研磨棒在冰水浴条件下机械匀浆，制成20 %的组织匀浆，将离心机预冷，用离心机在2 500转/min下离心10 min，离心完成后取其上清液进行测定。酶活力测定采用南京建成生物工程研究所生产的脂肪酶（LPS）测定试剂盒，将2 mL底物缓冲液和25 μL 20 %组织匀浆混合，加入25 μL试剂四，室温下用酶标仪在420 nm处测量吸光度。脂肪酶酶活力定义：在温度为37 ℃下，每克组织蛋白在本反应体系中与底物反应1 min，每消耗1 μmol底物为一个酶活力单位。

计算公式：脂肪酶活力（U/g）=（A1-A2）/AS×标准管浓度（454 μmol/L）×反应液总体积（2.05 mL）/取样量（0.025 mL）/反应时间（10 min）/待测样本蛋白浓度（g/L）。

式中：A1为样本待测溶液在石英比色皿中，波长为420 nm下，准确计时30 s时读取的吸光值；A2为样本待测溶液在37 ℃水浴锅中水浴10 min后倒回比色皿中，波长420 nm处，计时30 s时读取的吸光值；As为2 mL底物缓冲液和50 μL生理盐水充分混合后，在波长为420 nm处测量吸光值。

1.4.7 数据的处理与统计分析 试验数据均以平均值±标准差来表示。所测数据采用“SPSS version 19.0”软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）；统计间若有显著差异，再用Duncan法进行多重比较，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 养殖密度对银鲳生长的影响

3个密度组银鲳幼鱼的增重率、特定生长率如图1、图2所示。中密度组（60 ind/m3）银鲳幼鱼的增重率与特定生长率分别为（235.19±10.23）%、（4.03±0.10）%，显著高于低密度组（P<0.05），高密度组（90 ind/m3）幼鱼的增重率与特定生长率分别为（196.00±24.25）%、（3.61±0.27）%，均略低于中密度组，但无显著性差异（P>0.05），从增重率和特定生长率这两个指标来看，中密度组>高密度组>低密度组。

在养殖周期内，不同密度组下银鲳幼鱼的生长方程曲线如图3所示。其中低密度组生长方程为W=-0.007 2 t2+0.478 3 t+6.242，R2=0.826;中密度组生长方程为W=-0.002 8 t2+0.364 9 t+5.362 1，R2=0.938;高密度组生长方程为W=-0.004 6 t2+0.397 1 t+4.903 6，R2=0.939。在0～5 d时，银鲳幼鱼的增长幅度最大，其中低密度组增长率为132.6%，为同时期中密度组的1.09倍，高密度组的1.36倍。之后，不同密度组的增重率均有所放缓。至5～10 d时，低密度组的增重率为16.0%仍高于中密度组。而在10～20 d、20～30 d、30～40 d这几个周期内，中密度组的增长率分别为21.2%、15.4%和26.3%，均高于同时期的低密度组和高密度组。根据生长方程预测，三个密度组在0～5 d时都处于快速增长时期，20 d后低密度组增重变得缓慢，高密度组的增重较中密度组有所下降，而中密度组仍保持相对稳定的增长。