秦皇岛地区克氏原螯虾源嗜水气单胞菌分离及生物学特征分析

摘 要：为鉴定引起克氏原螯虾死亡的病原菌及分析其生物学特征，从秦皇岛地区病死的疑似细菌感染的克氏原螯虾的肝脏和胰腺分离出1株病原菌，暂定名为ProcQHD。经细菌分离鉴定和16S rRNA基因序列分析，该菌株被鉴定为嗜水气单胞菌。通过人工感染动物试验、PCR法及K-B药敏纸片对其致病性、毒力基因、耐药基因及耐药性进行了研究。结果表明，ProcQHD株的LD50为1.0×105 CFU/mL，携带ser、 act、 exu、 lip和Luxs 5种毒力基因；ProcQHD株对替米考星、头孢曲松、环丙沙星、土霉素、诺氟沙星等12种药物高度敏感且携带Tet（A）、 Tet（C）、 Tet（E）、 qepA、 gyrB、 aac4、 aadB、 Ant-Ia、 Sul-1、 LAP-1、 SHV 11种耐药基因。分析发现ProcQHD株的某些耐药表型与耐药基因之间有一定相关性。

关键词：克氏原螯虾（Procambarus clarkii）；嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）；致病性；毒力基因；耐药性；耐药基因

中图分类号：S968.22

克氏原螯虾（Procambarus clarkii），又名小龙虾，属于原螯虾属，原产于美洲大陆的美国南部及墨西哥北部，20世纪30年代引入中国，主要饲养于长江中下游地区，成为了我国水产养殖中重要的经济动物[1-2]。克氏原螯虾病害高发期是每年的4—6月份，临床中以细菌性疾病为主，感染率和死亡率均较高，严重影响克氏原螯虾养殖业的发展[3]。目前，我国所报道的引起克氏原螯虾大规模发病的病原菌主要有嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和弗氏柠檬酸杆菌（Citrobcter freundii）等[4]。

嗜水气单胞菌（A. hydrophila）属于弧菌科气单胞菌属，主要分布于自然水体、土壤及鱼体内，可以感染不同种类的鱼类、鸟类、爬行类及两栖类动物，主要引起肠炎、皮肤病、败血症等疾病[5-6]。A. hydrophila也可通过食物感染人类，引起人的腹泻、肠炎，严重者会导致败血症等，是一种人-畜-水生动物共患病原菌[7]。嗜水气单胞菌还是一种重要的食品病原，目前已有报道从动植物食品中可以分离到嗜水气单胞菌，如蔬菜、肉类制品、奶制品等均有报道。因此，加强该菌的控制已刻不容缓[8]。

许多研究表明，A. hydrophila 能分泌多种毒力因子，有些毒力基因可以作为鉴别致病性嗜水气单胞菌的标志，敲除相关的毒力基因可以降低其致病力。因此，A. hydrophila毒力基因与其致病力密切相关[7，9-10]。水产养殖动物的嗜水气单胞菌防治以抗生素为主，由于滥用已出现严重的耐药性，对水环境也造成了一定程度的污染，同时还危害人类的健康[11-12]。笔者试图从克氏原螯虾体中分离出单一的嗜水气单胞菌，并对其致病性、毒力基因、耐药性及耐药基因等生物学特征进行分析，以期为小龙虾嗜水气单胞菌疾病防治及药物合理利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

秦皇岛昌黎县某养殖基地的25 d病死克氏原螯虾，在无菌条件下，取其肝、胰脏、肠道组织进行细菌分离鉴定。

1.2 主要试剂

RS琼脂培养基、TSB（胰蛋白胨大豆肉汤培养基），均购自青岛海博生物；细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；Raid ID 32E阴性鉴定试纸条购自bio-Merieuxsa公司；DL2000 Marker购自北京中科康泰生物科技有限公司；2×Taq Marker Mix购于北京康为世纪生物科技有限公司。

1.3 细菌分离与培养

无菌的条件下，将病死克氏原螯虾肝、胰脏、肠道组织接种于绵羊鲜血平板上，倒置于28 ℃恒温培养箱中18～24 h后，挑选平板上的单个优势菌落，在RS培养基划板，进一步培养。24 h后挑取培养基上单个菌落接种于TSB中进行纯化培养。对纯化后培养得到的菌株进行革兰氏染色，电镜观察。分离菌株暂定命名为ProcQHD株。

1.4 生化试验鉴定

根据Raid ID 32E革兰氏阴性菌生化鉴定试条的说明书，将纯化培养后得到的菌株培养至菌液浓度为OD600nm≈0.5时，接种于生化鉴定试条中，并在37 ℃恒温湿盒中培养24～48 h后，用ATB自动化微生物生化鉴定系统进行生化特性鉴定。

1.5 细菌的PCR鉴定

参考文献[7]中报道的细菌通用16S rRNA基因序列引物5'-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3'/5'-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3'由上海生工生物工程有限公司合成。分离菌株的DNA利用细菌基因组DNA试剂盒提取，并以其为模板，进行PCR鉴定。将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳验证，并利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收基因片段。将目的片段16 ℃过夜连接至pMD18-T载体上，挑取阳性质粒，由生工生物工程（上海）股份有限公司测序，其测序结果与GenBank中已登录序列进行同源性比对，用BLAST软件构建系统进化树。

1.6 致病性试验

将分离纯化培养的菌液培养至对数期（OD600nm=0.8）时，采用10倍梯度稀释，进行滴板计数，调整菌液浓度。将60尾健康、体重一致的克氏原螯虾分为6组，每组10尾。1—5组每尾注射上述菌液200 μL，按组分别注射浓度为1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108 CFU/mL的菌液，第6组为对照组，注射等量无菌的1×PBS。于攻菌12 h后，连续观察15 d，记录每组发病及死亡情况，利用改良寇氏法计算分离菌株的LD50。

1.7 毒力基因检测

参照文献[13]，设计9种嗜水气单胞菌的毒力基因引物（act、aha、exu、aer、Luxs、Lip、Hly、ompA和Ser），由上海生工生物工程有限公司合成。以提取的基因组DNA为模板。用PCR进行毒力基因检测，回收PCR产物进测序，其测序结果与GenBank中登录的序列用DNAStar软件进行同源性分析。

1.8 药敏试验

本研究药敏试验参照CLSI[14]推荐的标准K-B纸片法进行操作及结果判断。

1.9 耐药基因的检测

参照文献[15]，合成β-内酰胺类、四环素类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类、大环内酯类共6类耐药基因引物由上海生工生物工程有限公司合成。利用已提取的细菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增，回收PCR产物进测序，其测序结果与GenBank中已登录序列用DNAStar软件进行同源性分析。

2 结果

2.1 分离鉴定结果

疑似嗜水气单胞菌分离菌株ProcQHD株在7%脱纤绵羊血培养基生长出：边缘整齐、呈β型溶血样的透明隆起菌落；在RS培养基上长出：大小一致、边缘整齐、稍隆起的黄色圆形菌落；革兰氏染色呈现散在或者成双排列的两端钝圆的阴性杆菌（封三，图1）；在透射电镜下，ProcQHD株菌体呈圆杆状，菌体表面不平整，且周生菌毛，周围有较细长的鞭毛，一端有长鞭毛（封三，图2）

2.2 细菌生化鉴定结果

ProcQHD株经ATB自动化微生物生化鉴定系统鉴定为嗜水气单胞菌，相似度可达99.9%（表1），ProcQHD株的生化特性与《伯杰氏系统细菌学手册》报道的嗜水气单胞菌的生化特性基本上一致，ProcQHD株初步判定为嗜水气单胞菌。

2.3 细菌PCR鉴定与测序结果

用16S rRNA通用引物对ProcQHD株进行PCR鉴定，结果显示，ProcQHD株，扩增出大约为1 500 bp的目的基因的条带（封三，图3）。目的片段纯化回收，送上海生工生物公司测序，测序结果与GenBank中已登录序列比对，并用DNAstar软件进行同源性分析，结果显示，ProcQHD菌株与GenBank中登录的10株嗜水气单胞菌参考株基因序列同源性在98.9%～99.9%之间，16S r RNA系统进化树可见与CP016989株聚为一支，亲缘关系最近（封三，图4），表明分离的ProcQHD菌株为嗜水气单胞菌。

2.4 致病性试验结果

健康克氏原螯虾在腹腔注射不同浓度菌悬液后，于攻毒的3～4 d，出现发病，剖检死亡的克氏原螯虾肝脏、肠道，出现严重的出血，且采集病料组织分离得到了嗜水气单胞菌，经15 d结果观察，记录死亡数据（表2）。利用改良寇氏法计算分离菌株的LD50为1.0×105 CFU/mL。

2.5 毒力基因PCR检测结果

采用PCR方法检测ProcQHD株的act、aha、exu、aer、Luxs、Lip、Hly、ompA和Ser 9种毒力基因，结果显示，ProcQHD株携带ser、act、exu、lip和luxs 5种毒力基因 （图5）。ProcQHD株携带ser、act、exu、lip和luxs 5种毒力基因的测序结果与GeneBank中登录的A. hydrophila参考序列的同源性在97.4%～99.0%之间。

2.6 药敏试验结果

用K-B药敏纸片测定ProcQHD株耐药性，结果显示，ProcQHD株对阿米卡星、卡那霉素、链霉素、环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、土霉素、多西环素、氨苄西林、头孢曲松、替米考星等12种药物高敏。对复方新诺明中敏，对磺胺间甲氧嘧啶、青霉素、阿莫西林3种药物耐药（表3）。

2.7 耐药基因检测结果

采用PCR方法对四环素类、氟喹诺酮类、β-内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类及大环内脂类等药物的33种耐药基因进行检测，结果显示，ProcQHD株携带Tet（A）（344 bp）、Tet（C）（546 bp）、Tet（E）（544 bp）、qepA（570 bp）、gyrB（299 bp）、aac4（356 bp）、 aadB（412 bp）、Ant-Ia（284 bp）、Sul-1（425 bp）、LAP-1（729 bp）、SHV（843 bp） 11种耐药基因（图6）。其测序结果与GenBank中登录嗜水气单胞菌参考株基因序列同源性均＞98.0%。通过分析，ProcQHD株部分耐药表型与携带耐药基因之间有一定的相关性。

3 讨论

3.1 克氏原螯虾嗜水气单胞菌的分离鉴定

嗜水气单胞菌是水产动物养殖过程中常见病原菌之一，该菌为条件致病菌，当机体免疫力下降时可以引起发病，可以导致淡水鱼类的细菌性出血病。对多种水产动物具有较强的致病性，感染率和死亡率均较高，成为淡水鱼养殖过程中危害比较大的病原菌[16-17]。该病原菌对克氏原螯虾也有较大的危害，感染嗜水气单胞菌的克氏原螯虾在发病初期无明显症状，感染后期不摄食，反应迟钝，应急能力减弱，螯足及附肢无力，解剖后可见肝，胰腺颜色淡黄，腹节背部肌肉苍白，可造成严重的经济损失[8]。本次试验从25 d病死克氏原螯虾体内分离得到单一的病原菌，综合分析基本可以确定其为嗜水气单胞菌。通过人工感染动物试验验证其致病性，ProcQHD株的LD50为1.0×105 CFU/mL，致病性较强，为高致病菌株。该菌可能对克氏原螯虾存在潜在的威胁，在克氏原螯虾养殖过程中应该主要防控该菌。

3.2 克氏原螯虾嗜水气单胞菌的毒力基因

嗜水气单胞菌是多种水生动物的机会性感染的病原体，该菌的毒力基因和毒力的致病性具有多样性，携带不同毒力基因，其毒力的表达与致病具有一定的相关性。气溶素基因（aer）、溶血素基因（hly）是致病性嗜水气单胞菌标志性毒力基因，aer属于气单胞菌典型的外毒素基因且具有细胞毒性和溶血性，可以与红细胞膜表面的特殊受体结合，破坏红细胞，常导致出血病、败血症等[7，10]。本次试验研究表明ProcQHD菌株携带ser、act、exu、lip和Luxs 5种毒力基因，不携带aer、hly等毒力基因，且通过回归动物致病性试验，发现ProcQHD株具有很强的致病性。这说明嗜水气单胞菌致病性可能与携带的毒力基因有关，一种或几种毒力基因表达后可能会增强其致病性，也可参与侵染宿主，其致病机理有待进一步研究。