贡柑和沃柑E3泛素连接酶U-box基因的克隆
作者： 吴少平 覃飞 廖金燕 冼睿芊
摘要 为了研究贡柑和沃柑无籽形成的分子机理，选取了贡柑和沃柑作为研究对象，成功克隆了它们的E3泛素连接酶U-box基因。通过测序结果分析，发现贡柑和沃柑的U-box基因存在15个核苷酸差异，导致贡柑中有4个氨基酸发生了改变。通过序列比对，发现沃柑和无籽沙糖橘的E3泛素连接酶U-box基因相似度为98.19%，贡柑和无籽沙糖橘的E3泛素连接酶U-box基因相似度为97.72%，而沃柑和贡柑的E3泛素连接酶U-box基因相似度高达99.47%。
关键词 贡柑；沃柑；E3泛素连接酶U-box
中图分类号 S666 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2025）03-0101-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.03.020
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Cloning of E3 Ubiquitin Ligase U box Gene in Citrus reticulata cv.Gonggan and Orah mandarin
WU Shao ping1，QIN Fei2，LIAO Jin yan1 et al
（1.School of Life Sciences，Zhaoqing University，Zhaoqing，Guangdong 526061;2.Fruit Tree Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou，Guangdong 510610）
Abstract In order to study the molecular mechanism of seedless formation in Citrus reticulata cv.Gonggan and Orah mandarin，Citrus reticulata cv.Gonggan and Orah mandarin were selected as research objects，and their E3 ubiquitin ligase U box genes were successfully cloned.After analyzing the sequencing results，it was found that there were 15 nucleotide differences in the U box genes of Citrus reticulata cv.Gonggan and Orah mandarin，resulting in changes in 4 amino acids in Citrus reticulata cv.Gonggan.Through sequence alignment，it was found that the similarity of E3 ubiquitin ligase U box genes between Orah mandarin and Citrus reticulata ‘Wuzishatangju’ was 98.19%，while the similarity of E3 ubiquitin ligase U box genes between Citrus reticulata cv.Gonggan and Citrus reticulata ‘Wuzishatangju’ was 97.72%.The similarity of E3 ubiquitin ligase U box genes between Orah mandarin and Citrus reticulata cv.Gonggan was as high as 99.47%.
Key words Citrus reticulata cv.Gonggan;Orah mandarin;E3 ubiquitin ligase U box
基金项目 国家级大学生创新创业训练计划项目（202310580011）；肇庆市科技创新指导类项目（2023040308015）。
作者简介 吴少平（1981—），男，湖北蕲春人，讲师，博士，从事植物分子遗传育种研究。
收稿日期 2024-03-21
泛素化系统是细胞内一种特殊酶的体系，能将泛素连接到靶蛋白质上，在植物的生长和发育中扮演着多种调控角色［1］。这些特殊酶包括泛素激活酶、结合酶、连接酶和降解酶，其中E3泛素连接酶在泛素化过程中起着关键的识别靶蛋白质的作用。根据共价键连接方式，E3泛素连接酶可以分为U-box蛋白家族、HECT结构域和RING结构域［2］。U-box结构域是由70余个氨基酸残基组成的植物特有的高度保守的功能结构［3-4］。有研究表明，植物的E3泛素连接酶U-box基因在植物生长发育、应对生物和非生物胁迫等过程中扮演着重要的调控作用［5］。
花粉萌发是植物进行有性生殖的重要过程，花粉的正常发育直接影响雄性特性，如育性和自交亲和性等。据报道，植物的泛素化系统参与调控花粉的发育［1］。AtPUB4是一种U-box型E3泛素连接酶，其突变体所产生的植株花粉粒会被吸附在未完全分解的绒毡层中，导致难以正常从开裂的花药中释放，从而导致植株发生不育。这表明U-box型E3泛素连接酶在调控植物的花粉发育过程中起着重要作用，进而影响植物的繁殖生长［6-7］。邵麟惠等［8］通过对苜蓿进行研究，成功克隆了苜蓿的U-box基因（MtPUB4），结果表明，MtPUB4基因可能在苜蓿的生长发育和抗逆性中发挥关键的调节作用。在大豆中，宫宇等［5］克隆了E3泛素连接酶基因GmPUBl，转基因拟南芥株系中高表达GmPUBl基因的千粒质量显著提高，但种子萌发率下降，这说明GmPUBl基因在调控种子繁殖发育过程中起着重要作用。另一方面，葛城成等［9］研究发现了水稻中编码的U-box型E3泛素连接酶基因OsPUB67参与调控水稻对非生物胁迫的应对。同时，唐文武等［10］克隆了无籽沙糖橘的E3泛素连接酶U-box（CrU-box）基因，其基因表达分析结果显示CrU-box基因在沙糖橘子房中表达量最高，综合分析表明，沙糖橘无籽形成的原因可能是由于CrU-box基因突变以及自交授粉后的高表达。目前，在柑橘中关于U-box型E3泛素连接酶的鉴定和功能研究较为缺乏。笔者基于已有的研究基础，利用贡柑和沃柑作为材料，成功克隆出U-box基因，并探究其功能，旨在为进一步培育无籽贡柑和沃柑提供了理论支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选取贡柑和沃柑植株的叶片提取总RNA，贡柑和沃柑植株取自肇庆学院生物园（图1）。
1.2 试验方法
1.2.1 总RNA提取及cDNA合成。
总RNA提取按照Vazyme公司的FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit（RC411）试剂盒的操作步骤进行，通过紫外分光光度仪检测RNA浓度，并使用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，以评估RNA的质量。cDNA的第一链合成根据TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Code No.RR047A）试剂盒的说明书操作步骤进行。
1.2.2 CrU-box基因克隆。
参考甜橙基因组（http：//citrus.hzau.edu.cn）上Cs6g21870的U-box序列，设计引物Cs6g21870-F/R用于扩增贡柑和沃柑的U-box基因cDNA。PCR扩增反应体系总体积为50 μL，包括25 μL Phanta Max Master Mix（Dye Plus，Vazyme公司）、各2 μL Cs6g21870-F/R引物、500 ng cDNA模板，最后添加去离子水至50 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；34个循环，包括95 ℃变性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸5 min；终止4 ℃恒温。随后，利用TIANGEN公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（增强型，DP219）回收PCR产物，并连接到克隆载体pClone007 Versatile Simple Vector Kit（擎科生物）中。转化至大肠杆菌感受态DH5α（擎科生物），最终将验证过的阳性单克隆送至擎科生物公司进行测序（表1）。
2 结果与分析
2.1 CrU-box基因克隆
提取贡柑和沃柑叶片的总RNA后，测得其OD260/OD280比值均在1.8～2.1，表明RNA受到的蛋白污染较少，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，28S RNA和18S RNA条带清晰，说明DNA污染程度低（图2）。使用Cs6g21870-F/R引物扩增贡柑和沃柑的cDNA，结果如图3所示，产物条带单一，大小均在约3 000 bp。
2.2 贡柑和沃柑U-box基因序列分析
将贡柑和沃柑的cDNA扩增产物回收后连接到克隆载体上进行测序，DNA测序结果和蛋白质序列见图4和图5。据分析，贡柑和沃柑的U-box基因的开放阅读框（ORF）长度为31 50 bp，可以预测编码1 049个氨基酸的蛋白质。在ORF区域，贡柑和沃柑存在15个碱基对的差异，分别为第652、1 124、1 315和1 664位的T变为C，以及689、698、1 357、1 433、1 601、1 628和2 909位的G变为A，843和848位的T变为G，1 124和1 949位的A变为G，这些改变导致氨基酸发生变化。具体来说，第281位的缬氨酸变为甘氨酸，第282位的丝氨酸变为精氨酸，第438位的缬氨酸变为丙氨酸，第452位的精氨酸变为谷氨酰胺（图5）。
3 讨论与结论
U-box基因家族具备U-box结构域，编码的蛋白质大多数是泛素系统中负责底物识别的关键酶，即E3泛素连接酶。几乎所有植物体内都含有相当数量的U-box蛋白，如柑橘中已经报道存在56个U-box基因成员［11］，拟南芥包含64个U-box基因［12］，苜蓿鉴定出41个U-box基因［13］，番茄有56个［14］，水稻中共有77个［15］，雷蒙德氏棉中则发现了93个GrPUBs基因家族成员［16］。这些数据表明，不同植物中的U-box家族成员数量存在显著差异。
研究表明，柑橘中的U-box蛋白质为31.97～160.62 kD，等电点（PI）范围则在5.19～9.14。柑橘的U-box基因家族中，每个成员编码的蛋白质在大小和PI等特征上存在差异，除了含有U-box结构域外，U-box蛋白还具备TPR、WD40和ARM等次级结构域，这些结构域主要用于特异性识别U-box蛋白与底物蛋白之间的相互作用［11］。文献报道指出，U-box蛋白在植物生长发育中扮演着重要的调控作用，参与植物生长发育的不同阶段，包括根系的发育及生殖器官的成长等。植物具有自交不亲和性，是一种维持后代的机制，在植物进化过程中促使植物进行异花授粉，避免自花授粉，从而保持植物群体的多样性，避免种族的退化［17］。长期进化过程中，这种机制可以提高植物的遗传多样性，导致可育的雌雄同花植物在自花授粉后无法结实，表现为不育表型［18］。目前，贡柑和沃柑因其高产、稳产、易剥皮、果肉清甜爽口的品质而备受消费者喜爱，然而大多数商品性好的品种都含有种子，即使是无籽贡柑也并非完全不含种子，只是单个果实的种子数量较少。因此，培育无籽性成为柑橘品种改良的重要目标，而自交不亲和特性则是导致柑橘无籽果实形成的关键因素。