多花黄精叶斑病病原鉴定及拮抗菌对其抑制作用研究

IdentificationofPathogensofPolygonatummultiflorumLeaf SpotDiseaseandTheirInhibitionbyAntagonistic Bacteria HUXiu-hong1，HEJaZHANGTing-ietal（1.SholofLifeandHealthSience，KailiUniversityKailiGuzou556；.Qiandongnan Food and Drug Inspection and Testing center，Kaili，Guizhou ）

AbstractUsigplantswithtypicalsymptomsofPlygonatummultfomlafspotdiseaseasrawmaterials，tepatogenicfungiwereisolatedfromthediseasedleavesusingtisueisolationmetodMorphologicalobservationandequenceanalysisofribosoalDA-（nteal transcribedspacer）regionwereusedtoasifyandidentifeathogenicfungi.eibitoryectsoftheantagonisticacteiaGlu conobactereeliH-cillssubilisdcilsgm-ntpagefuieedulsot themainpathogenscausingteleafspotdiseaseofPlygoatumultiformreEicocmsorhumandPestalotiopsismicospaute searchhafondattetagosticacteuofBcilussubtilisH-3dsrogiibitoetoothransofpatogsii tion rates of 91. 37% and 98.21% ，respectively；Bacillus magnetrium B-2 also had a strong inhibitory effect with inhibition rates of 44.98% and 95.49% ，respectively；whileGluconobacternepheli H-1onthetwopathogenicfungi mentionedabove wasrelativelyweak，withinibition rates of 31.89% and 50.41% ，respectively.In summary，Bacillus subtilis has the best antibacterial effect and can provide a basis for the research and development of biopesticides in the later stage.

KeywordsPlygoatummuliforu；eafspotdisease；PathognicfungiSeparationandidentification；Antagonisticbacterabioy effect

多花黄精（PolygonatumcyrtonemaHua.）又名姜形黄精、野生姜、黄精姜等，为百合科（Liliaceae）黄精属（Polygona-tum）多年生宿根草本植物，属于传统的中药材，是药食同源植物[1-2]。传统医学认为，黄精具有补肾益精、滋阴润燥之功效，长期用于治疗肾虚亏损、脾胃虚弱、肺虚燥咳、体倦乏力等症[3-4]。黄精共分为3种，即黄精（P.sibiricumRed）、滇黄精（P.kingianumColl.etHemsl）和多花黄精（P.cyrtonemaHua）[5-6] O

黄精是贵州省草本类中药材主要品种之一。目前贵州省9个市州均有黄精种植。2019年黄精被列为贵州省农村产业革命中药材7个重点品种之一。多花黄精，多数来源于野生采集，随着市场对多花黄精需求的增加和野生资源的急剧减少，野生多花黄精数量越来越少[6]。近年来，人工栽培的黄精规模逐渐扩大。研究发现，黄精在非适生区进行种植或在黄精生长过程中管理不到位，易造成黄精病虫害发生[7-9]。目前，黄精病害主要有叶斑病、黑斑病、枯萎病、灰霉病、根腐病、炭疽病等，其中黄精叶斑病、根腐病危害较严重[10-15]。笔者以黔东南镇远县黄精种植基地的多花黄精叶斑病为切入点，开展多花黄精叶斑病病原菌的分离与鉴定及拮抗菌对其抑制作用研究，以期为后期多花黄精病害的防治提供参考，同时在保证多花黄精的高产优质方面具有重要的实践意义。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1试剂与原料。琼脂粉、次氯酸钠，成都市科龙化工试剂厂；PDA（马铃薯葡萄糖）培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司；乳酸棉染液，珠海贝索生物技术有限公司。多花黄精叶斑病病株采集于镇远县多花黄精种植基地。

1.1.2菌种。拮抗细菌：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis，编号H-1）、葡糖杆菌（Gluconobacternephelii，编号H-3）从黄精块茎中分离；巨大芽孢杆菌（Bacillusmagaterium，B-2）从大叶韭菜根中分离。

1.1.3仪器与设备。FA2004型电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；SW-CJ-2D 型双人净化工作台，上海苏净实业有限公司；ZWY-CZ11D型恒温摇床培养振荡器，上海智诚分析仪器有限公司；BGZ-246型电热鼓风干燥箱、SPX-150B-Z型生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LDZX-50kbs型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂。

1.2 方法

1.2.1症状的观察和描述。观察并描述多花黄精叶片病变部位的病斑形态、颜色和发病部位及危害程度等，同时对发病部位进行拍照。

1.2.2病原菌的分离纯化与鉴定。采用组织培养法对多花黄精病叶进行组织分离，即取病健交界处的组织3小块，放在 75% 乙醇中浸泡 10s ，用无菌滤纸吸取遗留在组织上的乙醇，随后将组织放到 1% 次氯酸钠溶液中 30s ，然后用无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干表面残留的水，最后转移到PDA培养基上， 培养 3～5d. 。用接种针对长成的菌落进行平板2次纯化，直至获得纯培养为止。挑取菌落中央部分的菌丝置于载玻片上，滴入一滴乳酸棉染液，加盖玻片于显微镜下观察病原菌孢子大小与菌丝形态。

按SK8259试剂盒操作提取真菌基因组DNA，采用通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增：ITS1（ -TCCGTAGGTGAAC-CTGCGG- ）和ITS4（ -TCCTCCGCTTATTGATATGC - ）。扩增体系为 25uL，其中 10×PCR Buffer5.0uL，50mmol/LMgSO45.0uL，10mmol/L＼ d NTP2.0uL，5U/uLTaqDNA 酶0.5uL，正反向引物（10uLITS1和ITS4）各1.0uLDNA模板1.0uL，9.5uLPCR反应程序： 预变性 5min，94℃变性 复性 延伸 90s，30 个循环；后 延伸 10min 。PCR扩增产物通过 1% 琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR反应产物纯化后送上海生工生物工程股份有限公司进行测序。测序结果采用GenBank数据库中的BLAST进行比对，通过MEGA5.0软件中Neighbor-join-ing法构建系统发育树。结合形态学观察对致病菌进行分类鉴定[16]

按照Ezup柱式真菌基因组DNA提取试剂盒方法（生工）分离纯化菌株基因组DNA。根据原核生物16SrRNA保守序列通用引物[7]：27F（ GTT TGA TCC TGG CTC 和 1492r （ -TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T- ），以AW1-18的基因组DNA为模板，对该菌株的16SrRNA进行PCR扩增，采用 50℃反应体系，反应条件： 个循环； 10min 。PCR扩增产物送北京三博远志生物技术有限公司测序，测序结果在NCBI用Blast软件与GenBank中已知的相关属种的16SrRNA序列进行同源性分析，采用ClustalX1.83软件进行多序列比对8，用MEGA5.0软件包中Kimura 2-ParameterDistance模型进行多序列匹配排列[9]，用Neighbor-Joining法构建系统发育树[0]

1.2.3病原菌回接。取健康新鲜的黄精叶片，用 75% 乙醇擦拭表面进行消毒。参照文献[进行病原真菌孢子悬液的制备，采用针刺法和喷雾法给表面消毒后的黄精叶片进行菌悬液接种，以接种无菌水为对照。待叶片产生典型病斑后，依据柯赫氏法则，再通过组织分离法对病斑进行病原菌的分离纯化和形态鉴定。

1.2.4拮抗菌对优势病原菌的抑制作用。采用平板对峙法考察拮抗细菌对病原菌的抑制作用。无菌操作下，挑取1环拮抗细菌放入 100mL 牛肉膏蛋白陈液体培养基中，于180min30℃下摇床培养 18～24h ，无菌水稀释使菌液浓度为 。取 0.2mL 上述括抗细菌菌悬液进行平板涂布，涂布均匀后再在平板正中央接种一块 6mm 大小的病原真菌菌饼。以不涂布接种拮抗菌只接种病原真菌的培养皿为对照组，平行3次试验，将各组培养血放人 恒温培养箱中培养 3～7d ，待对照组真菌菌落长至平皿直径（ 90mm， 的4/5时，测定对照组和试验组中的菌落直径，并计算抑菌率。