2种方法测定抑菌剂对桑黄绿木霉的抑菌效果

Two Methods for Determining the Antibacterial Efect of Antibacterial Agents onPhellinus Trichoderma virens HUOXiu-juan，Mhuagui（1.Microbiologyesearchnstute，GuangiAcademyofAgriculturalSiences，Naninguangi ；2. Beijing Jingcheng Biotechnology Co.，Ltd.，Beijing 102600）

AbstractTrichodeastrainswereisolatedfromfungalpackagescontaminatedithTrichodermaspp.andgreenmoldspecimensofartifal lycultivatedpeliusfrutigoiesetsofnnfugiidesoTichodeairensu-3rdtedbbiiooe methodandgrowthatemethodTesultsshowdthatall5raisoficodeaisolatedwredentifedasrcoderiedoo toxicityestresultssowedtatprochloraz，gaoxiaolueijngtrchoderacid，carbendazimandhiopanate-methladstrongacteral efectonrichodermrensMu-3strain，andouldbeusedalteatelyorixedinchemicalcontrol.Relativelyspeakingtheiibitionzoe methodwasmoesuitablefoualitiest；tegowthatemetodouldauatelyfltteviuleeoftdrugtoteacteriah was not only suitable for qualitative test，but also suitable for quantitative test.

KeyWordsPhelinus；Trichoderma virens；Inhibitionzonemethod；Growthratemethod；Antibacterialefect；Toxicitytest

木霉（TrichodermaPers.）菌丝生长速度快，具有很强的寄生性，是香菇、平菇、金针菇、木耳、金耳、蛹虫草、灰树花、杏鲍菇和双孢蘑菇等食用菌的致病菌和主要竞争性杂菌[1-8]。不同地方的木霉种类不一样，其中绿色木霉（Tri-choderma viride）和哈茨木霉（T.harzianum）是优势菌[9-10]在食用菌栽培过程中，木霉污染会发生在任何时期，典型表现为产生绿色、黄绿色霉层，污染菌包或培养料，侵染食用菌的菌丝体和子实体，引发病害，并造成减产，影响产品的产量和品质。防治木霉最常用的方法就是用杀菌剂进行环境消毒，降低菌原基数，减少因杂菌带来污染或者侵染。杀菌剂毒力是评价其活性的重要参数，室内离体毒力测定方法因其快捷、灵敏和易操作，受到广泛应用。传统的杀菌剂室内毒力测定方法有抑菌圈法、孢子萌发法和生长速率法等[1]，生长速率法是将药剂与培养基混合，以培养基上菌落的生长速度来衡量药剂毒力大小。抑菌圈法又叫扩散法，是利用药物在琼脂平板中扩散使其周围的细菌生长受到抑制而形成透明圈，即抑菌圈，根据抑菌圈大小判定待测药物抑菌效价的一种方法。

该研究从被致病木霉侵染的桑黄菌包和桑黄子实体上分离得到5个木霉菌株，并优选了施保克、高效绿霉净和多菌灵等9种高效、低毒低残留的抑菌剂，分别用抑菌圈法和生长速率法测定这些抑菌剂对绿木霉 菌株的抑菌效果，对2种方法获得的结果进行比较和评价，为杀菌剂室内生物测定提供参考，也为木霉等食用菌栽培中污染菌的科学防治提供依据。

1材料与方法

1.1桑黄寄生木霉菌株的分离纯化和鉴定分别从南宁、龙州等试验基地的试验大棚选取被木霉污染的菌包和被木霉侵染的杨树桑黄子实体病样标本，在无菌工作台上削去表面组织，用尖头镊子挑取病部桑黄组织，接种到PDA平板培养基上，置于（ 恒温培养箱中进行黑暗培养 3～4d 等菌落中出现绿色孢子时，用镊子挑取少量菌丝，在显微镜下观察，根据分生孢子梗形态和分生孢子的形态大小鉴定木霉种类[12]，同时选取典型菌落进行转管纯化培养， 冰箱中保存备用。

1.2供试药剂及其生产厂家多菌灵 50% 可湿性粉剂，江苏蓝丰生物化工有限公司；甲基硫菌灵 70% 可湿性粉剂，美国默赛技术公司：恶霉灵 30% 水剂，东莞市瑞德生物科技有限公司；中生菌素 3% 可湿性粉剂，东莞市瑞德生物科技有限公司；过氧化氢 3% 水剂，广东南国药业有限公司；绿霉霸50% 可湿性粉剂，永济市君宏应用化工厂；高效绿霉净可湿性粉剂，福建南平市农康生物技术有限公司；施保克 45% 水乳剂，苏州富美实植物保护剂有限公司；势克 25% 乳油，先正达投资有限公司。

1.3 生长速率法

1.3.1绿木霉菌株的活化。选取绿木霉 菌株作为试验菌株，将其接种到PDA平板培养基中，置于 恒温箱中黑暗培养3d，用直径 5mm 打孔器打出菌饼，备用。

1.3.2抑菌试验。采用无菌移液枪分别移取 1mL 已配制好各个浓度的9种测试药剂，注人至 99mL 已灭菌冷却至 的PDA培养基中，混匀，再将之均分到6个直径为9cm 的培养皿中，制备含药平板，以加 1mL 无菌水的PDA培养基为对照。待培养基凝固后，将木霉菌株接种至PDA含药平板培养基中央，每个处理设3个重复。接种后，将其置于 的恒温培养箱中黑暗培养，观察2株木霉在不同浓度含药平板上的生长情况。待对照长满平板时停止培养。采用“十"字测量法测量木霉菌落的直径。

1.3.3数据处理与分析。计算菌落的平均直径，并分别算出9种药剂在系列浓度下的抑菌率。公式如下：

抑菌率 对照菌落直径-处理菌落直径 C ×100% 对照菌落直径

1.4抑菌圈法

1.4.1供试木霉分生孢子悬浮液的制备。分别将木霉菌 接种到PDA平板，置于（ 恒温箱中黑暗培养5d，观察到菌落上产生大量绿色孢子后，在无菌条件下，用灭菌生理盐水（ 0.9% NaCl）稀释木霉分生孢子，混匀孢子悬浮液。通过血球计数板将木霉分生孢子悬浮液的浓度调整 个孢子/mL，备用。

1.4.2采用抑菌圈法（纸片扩散法）测定不同浓度抑菌剂的抑菌圈直径。制备PDA平板培养基，用无菌的移液器吸取0.5mL 供试菌的孢子悬液，滴到PDA平板培养基上，用无菌涂布器轻轻将菌液均匀涂布于培养基表面。用灭菌滤纸片（圆形，直径 50mm ）蘸取不同浓度的抑制剂，放置于平板培养基中央，每处理重复3次，以蘸取无菌水的滤纸片作为对照。然后将平板倒置于恒温培养箱中， 恒温箱中黑暗培养7d，采用“十"字测量法测量抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1桑黄致病木霉的鉴定通过组织分离纯化，从污染菌包和染病的桑黄子实体上共获得5个致病木霉菌株，将分离纯化的木霉菌株接种到PDA培养基上，等菌落表面形成大量绿色孢子时，挑取少量菌丝，在显微镜下观察，根据分生孢子和分生孢子梗的形态特征，将上述5个菌株初步鉴定为绿木霉（Trichodermavirens）。

2.2利用抑菌圈法测试9种药剂的不同浓度药液对绿木霉的抑制效果由表1可知，在抑菌圈法试验中，除过氧化氢外，其余8种杀菌剂对绿木霉 菌株均有不同程度的抑制作用，且随着杀菌剂药液浓度增加，抑制作用增强。其中，多菌灵200mg/L甲基硫菌灵200mg/L，$ 高效绿霉净1mg/L 施保克 1mg/L 势克 、恶霉灵 、中生菌素 绿霉霸 1000mg/L 及其更高浓度处理对绿木霉 均有明显的抑制作用；然而，多菌灵 20mg/L 、甲基硫菌灵 20mg/L 、恶霉灵400和40mg/L、中生菌素 绿霉霸 势克 0.1mg/L 和过氧化氢所有的浓度处理均未见明显的抑菌圈，也未见明显的抑制作用。此外，绿霉霸各浓度处理对绿木霉 Mu-3 虽然也有抑菌圈，但是抑菌圈不够清晰，抑菌圈内部肉眼可见有菌丝生长，只是气生菌丝很稀薄。

从抑菌浓度和相应的抑菌圈直径2个方面进行综合评估，9种供试药剂对绿木霉 的抑制效果从大到小依次为施保克 > 高效绿霉净 > 多菌灵 > 甲基硫菌灵 > 势克 > 中生菌素 > 绿霉霸 恶霉灵 > 过氧化氢。