气相色谱三重四极杆质谱法检测茶叶中11种香精成分

我国作为世界产茶大国，其产量和销量均位居前列，茶叶因其具有独特的口感风味和保健作用，是一种受消费者喜爱的食品[1]。随着消费者食品安全意识的增强，茶叶中的食品安全问题如农药残留、重金属等问题引起人们的关注[2-3]近年来，茶叶中非法添加香精香料的问题开始引起广泛关注。据广东经济科教频道新闻报道，一些不法商家受经济利益的驱动，以次充好，在茶叶中添加香精[4]。然而，按照GB2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定，茶叶不得添加香精。因此，为判定茶叶中是否添加了香精，有必要建立相应的检测方法。目前，直接检测茶叶中特定种类的香精化合物是判断茶叶中是否添加香精较直接的方法。

茶叶中检测香精的方法主要有气相色谱质谱法（GC-MS）和液相色谱质谱法（LC-MS）。陈玉珍等[建立了气相色谱-四级杆/飞行时间质谱检测茶叶中10种香精的方法，该方法采用单级质谱测定，但是茶叶中风味化合物种类较多，难以区分同分异构体，检测结果易出现假阳性。气相色谱串联质谱法（GC-MS/MS）是在GC-MS的基础上增加了二级质谱信息，检测结果较单极质谱更准确。王玉娇等建立了GC-MS/MS快速检测茶叶香精的方法，该方法能够准确测定茶叶中6种香精，但检测香精的种类较少。LC-MS也可以用于茶叶中香精的检测8，但由于香精主要为小分子化合物，部分化合物不适合采用LC-MS检测，因此LC-MS检测香精的范围有限。另外，由于茶叶基质复杂，基质效应对检测准确性影响较大。因此同时检测茶叶中多种香精前处理净化环节十分重要。目前，茶叶香精检测过程常用的净化方法包括分散固相萃取（dSPE）技术[9、固相萃取（SPE）技术[10]、固相微萃取（MSPE）技术[1]、顶空气相色谱质谱法[12]等。dSPE技术具有操作简单、快速高效、成本低廉的优点，但净化效果没有SPE技术好。MSPE技术适合多种风味化合物测定，但重现性较差。相比而言，SPE技术能够很好地减小茶叶基质干扰，大大提高样品的处理量，简单可靠、能克服茶叶的基质效应，在茶叶分析前处理上应用较好。顶空气相色谱质谱法操作简单，可以避免非挥发性杂质对检测的影响，对于易挥发化合物检测灵敏度高，不易挥发化合物灵敏度低，因此检测香精种类有限[12]。该研究针对茶叶香精检测中检测方法、前处理净化方法存在的问题，选择消费量最大的绿茶和以香气为特色的茉莉花茶为研究对象，根据文献报道可能添加的香精种类建立同时检测茶叶中11种香精（1，8-桉叶素、侧柏酮、樟脑、胡椒酚甲醚、胡薄荷酮、2-己基噻吩、桂皮醛、茴香烯、香豆素、反式-β-金合欢烯、反式-甲基异丁香酚）的方法，再对市售绿茶及茉莉花茶进行香精成分检测，建立一种同时检测茶叶中多种香精化合物的方法，为相关部门的监管提供技术支持。

1材料与方法

1.1试验材料8890-7000D气相色谱三重四极杆质谱仪（美国Agilent）；ME204分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；Velocity10R离心机（澳大利亚Dynamica）；涡旋振荡器（其林贝尔仪器制造有限公司）；水平振荡器（日本TAITEC）；高纯水仪（美国 Millipore）；N-Evap 氮吹仪（上海安谱实验科技股份有限公司）。

SelectCoreTMDPT（ ， 6mL ）SPE柱（纳谱分析技术有限公司）；弗罗里硅土（ 1000mg ， 6mL ）净化柱（山东青云实验耗材有限公司）；QuEChERSdSPEGB23200.113TeaandSpiceQuEChERS净化包（安捷伦科技有限公司）。乙酸乙酯、乙腈（色谱纯，美国Honeywell公司）；无水硫酸镁、氯化钠、乙酸钠（分析纯，天津恒兴试剂有限公司）；乙酸（分析纯，科密欧试剂有限公司）；甲苯（分析纯，烟台双双化工有限公司）。1，8-桉叶素、樟脑、胡椒酚甲醚、桂皮醛、茴香烯、反式-甲基异丁香酚（标准品，上海安谱实验科技股份有限公司）；侧柏酮（标准品，梯希爱化成工业发展有限公司）；胡薄荷酮、反式- -金合欢烯（标准品，叶源生物科技有限公司）；香豆素（标准品，Dr.Ehrenstorfer）；2-已基噻吩（标准品，上海阿拉丁生物试剂有限公司）。茶叶（网售，绿茶、茉莉花茶）。

1.2 试验方法

1.2.1样品前处理。取 500g 茶叶经粉碎后过60目筛，密封保存，即为茶叶试样。称取2g茶叶试样于 50mL 塑料离心管中，加 10mL 水涡旋混匀，静置 30min 。加人 10mL 乙腈-醋酸溶液（乙腈-醋酸溶液 99：1 ，即量取 10mL 醋酸加入990mL 乙腈中，混匀） ？6g 无水硫酸镁 醋酸钠及1颗陶瓷均质子，盖上离心管盖，剧烈振荡 1min 后 5000r/min 离心 5min ，取 5mL 上清液（茶叶提取液）加入活化后的弗罗里硅土净化柱，用乙腈/甲苯（ 3：1 ，体积比）溶液洗脱，收集洗脱液 10mL ，混合均匀；经0.45um尼龙针式过滤器过滤后，待测。

1.2.2空白基质和空白基质液。取市售绿茶茶叶试样，按照"1.2.1"方法得到茶叶提取液，茶叶提取液经氮气吹干去除挥发性化合物，以此获得空白基质，空白基质加入 5mL 乙腈-醋酸溶液复溶后继续按照“1.2.1"方法过弗罗里硅土净化柱，洗脱液经0.45um尼龙针式过滤器过滤后得到的上机液为空白基质液。

1.2.3 标准溶液配制。

1.2.3.1 标准储备液。分别称取 10mg 的1，8-桉叶素、侧柏酮、樟脑、胡椒酚甲醚、胡薄荷酮、2-己基噻吩、桂皮醛、茴香烯、香豆素、反式 -β- 金合欢烯、反式-甲基异丁香酚于10mL 容量瓶中，用丙酮定容，分别配制成1000ug/mL的标准储备液。

1.2.3.2标准品混合中间液。分别量取100uL樟脑、胡薄荷酮、胡椒酚甲醚、1，8-桉叶素、2-己基噻吩、侧柏酮和反式-甲基异丁香酚， 1000uL茴香烯、反式- ？β- 金合欢烯、桂皮醛、香豆素的标准储备液于 10mL 容量瓶中，用丙酮定容并混匀，配制成标准品混合液。取 1mL 标准品混合液加入空白基质液定容至 10mL ，配制成樟脑、胡薄荷酮、胡椒酚甲醚、1，8-桉叶素、2-己基噻吩、侧柏酮和反式-甲基异丁香酚1g/mL，茴香烯、反式-β-金合欢烯、桂皮醛、香豆素10g/mL的标准品混合中间液。

1.2.3.3基质标准工作液。分别准确移取标准品混合中间液5，10，50，500，1000uL，分别加入空白基质液995、990、950，500，0uL，配制成樟脑、胡薄荷酮、胡椒酚甲醚、1，8-桉叶素、2-己基噻吩、侧柏酮和反式-甲基异丁香酚0.005、0.010、0.05、0.50、1.000g/mL，茴香烯、反式- ？β -金合欢烯、桂皮醛、香豆素浓度 0. 05、0.10. 50、5.00、10.00g/mL的基质标准工作液。

1.2.4仪器参数。

1.2.4.1气相色谱条件。色谱柱为 HP-5 毛细管色谱柱（30～0.25～0.25～m；载气为氮气，流速 1.0mL/min 不分流进样；进样口温度 ；柱温箱升温程序： 保持1min ，以 升至 . 升至 ；传输线温度 。

1.2.4.2质谱条件。电离方式为电子轰击离子源（EI源，电子能量 70eV ，离子源温度 ），采集方式为多反应监测（MRM）。待测化合物定量离子对、定性离子对、碰撞能量及保留时间见表1。

1.3数据统计分析上机测定基质标准工作曲线，以化合物浓度 为横坐标、定量离子对峰面积（Y）为纵坐标，采用安捷伦MassHunter数据处理软件进行线性回归，绘制标准曲线，得到标准曲线方程。分别测定待测液的定量离子对峰面积，代入标准曲线方程计算得到待测液中的各化合物浓度，基质外标法定量。

净化方式通过基质效应和回收率评价。该研究采用的基质效应计算公式参照文献的方法[13]，计算公式如下：

ME=B/A×100%

RE=C/B×100%

式中：ME为前处理过程总基质效应 （%） ；RE为前处理过程回收率 为目标化合物在纯溶剂基质中检测的峰面积； B 为目标化合物在阴性样品处理液基质中检测的峰面积； C 为目标化合物经过前处理后处理液基质中检测的峰面积。

2 结果与分析

2.1质谱条件的优化分别量取10uL标准储备液于10mL 容量瓶中，用丙酮定容并混匀，配制1.0ug/mL的11种香精标准物质。按照“1.2.4”气相色谱和质谱条件进样，采用质谱全扫描模式获取11种香精标准物质质谱图。根据质谱图与NIST14谱库中标准质谱图进行比对，确认化合物分子碎片信息，并通过优化碰撞能量，确定定量离子对、定性离子对。11种香精的定量离子对、定性离子对、碰撞能量见表1。

2.2色谱柱选择及色谱条件优化气相色谱常用的色谱柱按照极性可分为强极性、中极性和弱极性。该研究为获得较好的推广应用效果，使用通用性最强的弱极性色谱柱 HP-5 。为了获得较好的分离效果，选择并优化了升温程序，11种香精在HP-5柱分离效果见图1。从图1可以看出，11种香精在HP-5柱上分离效果较好。

注：1.1，8-桉叶素；2.侧柏酮；3.樟脑；4.胡椒酚甲醚；5.胡薄荷酮； 6.2-已基噻吩；7.桂皮醛；8.茴香烯；9.香豆素；10.反式 -β- 金 合欢烯；11.反式-甲基异丁香酚。