绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法的建立与应用

摘要  ［目的］建立一种诊断绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR方法，确定肺炎支原体感染的靶器官。［方法］根据GenBank网站上登录的绵羊支原体16S rRNA基因序列，设计并合成2对引物，以肺炎支原体菌株基因组DNA为模板，经过PCR反应条件的优化，通过测序验证扩增产物的正确性，建立了绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR检测方法，进而应用建立的方法完成临床阳性病料肺脏、肺淋巴、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、皮肤、小肠和外周血检测以及疑似样本肺脏组织的检测。［结果］建立的巢式PCR方法可扩增出864 bp的特异性目的片段，肺脏和肺淋巴为绵羊肺炎支原体感染的靶器官，临床样本巢式PCR检出率与支原体培养鉴定结果的符合率为100%。 ［结论］建立的绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法可用于临床样本的实验室诊断。

关键词  绵羊肺炎支原体；巢式PCR；检测方法

中图分类号  S852.62  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）04-0074-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.04.015

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Establishment and Application of Nested PCR Detection Method of Pathogens of Mycoplasma ovipneumonia

YANG Hua1，2，ZHOU Hua.qian1，2，HUANG Xin1 et al

（1.State Key Laboratory of Sheep Genetic Improvement and Healthy Production， Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science， Shihezi， Xinjiang 832000;2.College of Animal Science and Technology， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000）

Abstract  ［Objective］In order to establish a nested polymerase chain reaction （PCR） for detecting the pathogens of Mycoplasma ovipneumonia， and determine the target organs of mycoplasma infection. ［Method］According to the 16S rRNA sequence of sheep mycoplasma in GenBank website， two pairs of specific primers were designed and synthesized. PCR reaction conditions were optimized by using the genome DNA of M. ovipneumonia as templates. The nested PCR products were verified by sequencing. A nested PCR method for detecting the pathogens of M. ovipneumonia was established. The established method was used to detect the  lung， lung lymph， heart， kidney， liver， spleen， skin， small intestine and peripheral blood of clinical positive samples， and the lung tissue from clinical suspected samples. ［Result］864 bp specific gene fragment was amplified by using nested PCR method. The lung and lung lymph of sheep were the target organs of mycoplasma infection. The coincidence rate between the detection rate of clinical samples by the nested PCR and pathogen culture and identification results was 100%. ［Conclusion］The nested PCR method for detection of M. ovipneumonia could be applied for the laboratory diagnosis of clinical samples.

Key words  Mycoplasma ovipneumonia；Nested PCR；Detection method

基金项目  新疆维吾尔自治区肉毛兼用绒毛用羊品种选育提升计划项目（2022XJRMY-03）；新疆生产建设兵团农业科技创新工程专项（NCG202211）；新疆生产建设兵团重大科技项目（2017AA006）；国家肉羊产业技术体系项目（CARS-38）。

作者简介  杨华（1977—），男，湖南长沙人，研究员，博士，从事动物遗传育种与繁殖研究。

收稿日期  2023-03-05

羊支原体肺炎又称羊传染性胸膜肺炎，是危害世界养羊业的主要传染病之一。绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）是引起绵羊增生性、间质性支原体肺炎的主要病原［1］，可通过空气、飞沫、饮水等途径传播，具有高度接触传染性，主要临床症状有喘气、咳嗽、高热、精神萎靡、渐进性消瘦和慢性增生性间质性肺炎等［2］。绵羊在每个季节均可感染肺炎支原体，但春季和冬季的感染率最高，1—3月龄羔羊最易感染发病，感染率髙达95.3%，病死率达到27.5%［1］。绵羊肺炎支原体的感染范围十分广泛，呈全世界范围分布和流行，尤其在养羊业比重较大的不发达国家发病率较高，造成了一定的经济损失，严重影响养羊业的发展。

绵羊肺炎支原体主要引起肺脏的病变，还可以造成心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑、淋巴结的损害。一般认为绵羊肺炎支原体的靶器官是肺脏，临床上主要表现为呼吸道症状，通过病原分离培养和PCR检测，在包括肺脏在内的多个器官中检测到支原体。因此，研究人员认为肺脏不是肺炎支原体感染的唯一靶器官［3］。目前，用于绵羊肺炎支原体常规诊断的方法包括病原分离培养鉴定、血清学检测、免疫组织化学检测、酶联免疫吸附试验（ELISA）检测，近些年也出现了核酸探针和PCR等较为先进的检测方法［4］。但是，核酸探针需要放射性同位素标记，不易普及。巢式PCR是在常规PCR的基础上，以第1轮PCR扩增产物为模板进行第2轮PCR扩增，经2轮PCR得到目的基因片段。与常规PCR相比，巢式PCR的特异性和灵敏度更高［5］。巢式PCR已被用于牛肺炎支原体［6］、猪肺炎支原体［7］、细胞支原体［8］和恶性疟原虫培养中支原体［9］的检测，但未见到用于绵羊肺炎支原体的检测报道。笔者针对绵羊支原体16S rRNA序列设计引物，建立肺炎支原体巢式PCR诊断方法，进而检测分析临床病料肺脏和肺淋巴等9种组织中的肺炎支原体，明确肺炎支原体感染的靶器官，旨在为绵羊支原体感染的诊断、预防和流行病学调查提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  主要试剂。细菌基因组DNA提取试剂盒、血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DL2000 DNA Marker（天根生化科技（北京）有限公司）、Ex Taq酶（宝日医生物技术（北京）有限公司）、琼脂糖（Biowest公司）。

1.1.2  主要仪器。高速离心机（生工生物工程（上海）股份有限公司，中国）；PCR仪（杭州朗基科学仪器有限公司，中国）；电泳仪（北京六一生物科技有限公司，中国）；凝胶成像仪（UVP公司，美国）。

1.1.3  菌株。绵羊肺炎支原体菌株由省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室分离、鉴定，-80 ℃下保存。

1.2  方法

1.2.1  临床病料与病原分离。在试验区周边4个羊场采集53只疑似肺炎支原体病死绵羊的肺脏组织，3只健康绵羊屠宰后取肺脏组织。另外，采集经病原分离培养，确诊感染肺炎支原体病死绵羊的肺脏、肺淋巴、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、皮肤、小肠和外周血，制备EDTA-Na2抗凝血。支原体分离培养参考文献［10］的方法，以确定临床病例感染的病原。

1.2.2  引物设计。根据 GenBank 网站发表的绵羊支原体16S rRNA基因序列（GenBank登录号为EU265780.1），应用Primer Premier 5软件设计引物，引物序列见表1，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2.3  DNA提取。      应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取绵羊肺炎支原体菌株的基因组DNA，血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取外周血、肺淋巴、肺脏、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、皮肤、小肠组织的基因组DNA，以上均按照试剂盒说明书操作，提取的DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4  PCR反应体系和程序的建立。分别以提取的肺炎支原体菌株和阴性健康绵羊肺脏组织的基因组DNA为模板，进行巢式PCR扩增体系和扩增条件的优化。优化的第1轮扩增PCR反应体系（25 μL）如下：10×Ex Taq buffer（含Mg2+）2.50 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）2.00 μL，ovi1F（10 μmol/L）0.50 μL，ovi1R（10 μmol/L）0.50 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL，去离子水18.25 μL，基因组DNA（50 ng/μL）1.00 μL。将上述溶液混合，按以下程序进行PCR反应：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 5 min。第2轮扩增PCR反应体系（25 μL）如下：取1 μL第1次扩增产物，引物使用ovi2F和ovi2R，其余成分和使用量同第1次PCR。PCR反应程序同第1次PCR。PCR反应结束后，使用1.5%琼脂糖凝胶对5 μL PCR产物进行电泳检测。

1.2.5  PCR产物的测序验证。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化，与pMD18-T载体在25 ℃以下连接，转化到感受态细胞DH5α 中，在氨苄抗性平板上筛选出阳性克隆，提取质粒，经PCR鉴定为阳性的克隆质粒送交生工生物工程（上海）有限公司测序，序列用GenBank数据库BLASTN在线比对分析。

1.2.6

肺炎支原体感染的靶器官鉴定。以确诊感染肺炎支原体病死绵羊的肺淋巴、肺脏、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、皮肤、小肠和外周血组织的基因组DNA为模板，应用建立的巢式PCR方法检测绵羊支原体，PCR产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。