二倍体苍白茎藜组织培养研究

摘要  ［目的］建立藜麦二倍体苍白茎藜的组织培养体系。［方法］以二倍体苍白茎藜种子为外植体，先获得无菌幼苗，在此基础上进行不同脱毒外植体不同激素浓度配比对愈伤组织的诱导、不定芽分化的诱导、生根的诱导及移栽驯化的相关研究。［结果］二倍体苍白茎藜的种子最佳消毒时间为2%次氯酸钠消毒6 min；愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+1.0 g/L水解酪蛋白+35 mg/L肌醇+690 mg/L脯氨酸+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D，诱导率达到86.63%；不定芽分化诱导培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L 2-IP+1.0 mg/L KT，诱导率为11.67%；MS+2.0 mg/L IBA或MS+0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA为最佳生根培养基，生根率均达100%，试管苗经炼苗和移栽驯化后成活。［结论］该研究通过苍白茎藜种子诱导获得再生植株，经炼苗移栽驯化后成活，为二倍体藜麦的遗传转化体系的建立提供基础。

关键词  苍白茎藜；二倍体；组织培养

中图分类号  S519  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）05-0103-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.05.025

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on the Tissue Culture of Diploid Chenopodium pallidicaule

ZHANG Quan1， LIN Tong1， LIU Zheng-jie1，2 et al

（1.College of Agronomy and Biotechnology， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201;2.Research Center of Characteristic Small Population Crops， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201）

Abstract  ［Objective］In order to establish the tissue culture system of diploid Chenopodium pallidicaule. ［Method］Researches of callus induction， adventitious bud differentiation， rooting and transplanting were conducted by using the seeds of diploid Chenopodium pallidicaule. ［Result］The results showed that the best disinfection time of diploid C. pallidicaule seeds was 6 min under 2% sodium hypochlorite;the callus induction medium was MS+1 g/L hydrolyzed casein+35 mg/L inositol+690 mg/L proline+1.0 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D， the induction rate reached 86.63%;the induction medium of adventitious bud differentiation was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L 2-IP+1.0 mg/L KT， and the induction rate was 11.67%;MS+2.0 mg/L IBA or MS+0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA were the best rooting medium， with the rooting rate were 100%. ［Conclusion］Regenerated plants were obtained from the explants of C. pallidicaule seeds， and then survived after being domesticated， which provided a basis for the establishment of the genetic transformation system of diploid C. pallidicaule.

Key words  Chenopodium pallidicaule;Diploid;Tissue culture

基金项目  国家自然科学基金项目（32060421）；云南省科技厅外专引智项目（202105AQ130002）；云南农业大学第十四届学生科技创新创业基金项目（2021YPY001）。

作者简介  张全（1997—），男，黑龙江黑河人，硕士研究生，研究方向：植物组织培养。

*通信作者，教授，博士，从事作物生理学研究。

收稿日期  2023-03-16

藜麦（Chenopodium quinoa Willd.，2n=36）为苋科藜属（Chenopodium）四倍体一年生双子叶草本植物［1］。原产于南美洲的玻利维亚、秘鲁、厄瓜多尔和哥伦比亚等地区。约在5 000年前被驯化作为粮食及饲料作物。其籽粒含有均衡的不同种类的必需氨基酸、较高的蛋白质含量和高含量的矿质元素等平衡优越的营养，是印加人的重要食物，被称为“粮食之母”［2］。由于藜麦具有抗旱、耐低温、耐盐碱、耐贫瘠等强耐逆的特性，FAO 把2013年认定为“国际藜麦年”，突显了藜麦对全球粮食安全的重要作用，快速促进了全球藜麦的生产、消费与产业升级［3］。近年来，已被世界125个国家和地区引入作为新型农业生产的优选作物［4］。我国于2008年在山西、青海、陕西、甘肃、内蒙古、吉林、河北、四川及云南等省（区）开展引种、栽培示范及规模化种植，目前多个省份已经初步形成规模化的藜麦产业［5］。随着藜麦产业的快速发展，国内学者关注于藜麦营养、食品加工、栽培技术及育种研究。目前世界广泛种植的主要栽培种藜麦（quinoa）为一种异源四倍体（2A2B）物种，可能由二倍体的A基因组物种如苍白茎藜（Chenopodium pallidicaule Aellen）及B基因组物种如Chenopodium suecicum等的祖先物种通过杂交而形成［6］。二倍体的苍白茎藜（2A）是一种半驯化栽培作物，具有株型矮小、产量低、种子小的特点，作为栽培物种主要分布在安第斯山脉的高海拔地区［7］。苍白茎藜是研究四倍体藜麦的育种及遗传研究材料。近年已有学者报道四倍体藜麦的组织培养研究。1990年Komari等［8］仅涉及藜麦的愈伤组织诱导和原生质体培养。2005年Eisa等［9］从体细胞胚途径诱导藜麦再生植株，获得成功，但成苗率仅为5%。2015年俞涵译等［10］通过对藜麦外植体筛选，进而对藜麦愈伤组织诱导进行探索，在愈伤组织诱导方面取得成果，但有关愈伤组织分化不定芽鲜见报道。2016年Hesami等［11］采用藜麦下胚轴作为外植体诱导愈伤组织，仅研究可分化产生丛生芽。2018年曹宁等［12］采用茎段为外植体建立台湾红藜的再生，不定芽分化率最高为86.67%。2020年段鹏慧等［13］以藜麦带腋芽的茎段为外植体，初步建立了藜麦茎段的快繁体系。但至今有关二倍体苍白茎藜的组织培养研究却鲜见报道。笔者以二倍体苍白茎藜的茎段为外植体进行不同激素浓度的配比，并对愈伤组织、不定芽分化和生根的诱导以及试管苗的移栽成活进行研究，旨在为建立一套稳定的二倍体藜麦组织培养体系，为藜麦的遗传转化及基因功能研究提供良好的材料。

1  材料与方法

1.1  试验材料

植物材料为直接从玻利维亚引进的藜麦二倍体栽培种苍白茎藜（C.pallidicaule）PURA-PURANI。

1.2  二倍体苍白茎藜无菌外植体的培育

选取籽粒饱满的二倍体苍白茎藜PURA-PURANI的种子置于1.5 mL离心管中，用2倍体积的无菌水浸泡种子，并将离心管放入30 ℃水浴锅中2 h辅助种子充分吸涨，取出冷却至室温；随后用75%乙醇溶液消毒30 s，无菌水冲洗1次后置于2%次氯酸钠溶液中消毒6 min；最后用无菌水冲洗5次后接种到MS培养基上，每瓶培养基接种10～15粒种子。置于37 ℃进行2 d暗培养，转至光照时间12 h/d条件下培养15 d～30 d，获得无菌实生苗备用。统计污染率：

污染率（%）=污染数/接种外植体数×100%

1.3  二倍体苍白茎藜愈伤组织的诱导培养

将无菌苗的茎段剪成0.5 cm小段，置于表1中不同处理条件下的培养基中，其基本培养基为MS+水解酪蛋白1 g/L+肌醇35 mg/L+脯氨酸690 mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂，pH为5.8，添加不同浓度的植物生长调节剂。培养条件为（25±1） ℃，16 h光照。每个处理接种30个茎段，重复3次。接种14 d后统计愈伤组织的诱导及生长情况。

愈伤组织诱导率=出愈的外植体数/接种外植体数×100%

1.4  二倍体苍白茎藜愈伤组织的分化培养

选择生长良好、大小均匀的二倍体苍白茎藜愈伤组织，转接到表2中不同处理的培养基中，每个处理转接愈伤组织为20块，重复3次，培养30 d后统计不定芽的分化率与不定芽生长情况，以此筛选出诱导不定芽的最佳培养基。

再分化率=出芽外植体数/接种外植体数×100%

1.5  生根培养

二倍体苍白茎藜的不定芽长至3～5 cm，将其转移到含不同植物生长调节剂种类及不同浓度的培养基上，进行生根诱导培养。

生根率（%）=生根外植体数/接种外植体数×100%

1.6  炼苗移栽

选择长势健硕、根系生长良好的二倍体苍白茎藜组培苗，打开瓶盖，向瓶中注入自来水，使水在瓶中的高度达1～2 cm，保证瓶内100%的相对湿度，在室温中练苗3～4 d后，取出植株，将根部培养基洗净，移栽至含有已灭菌的基质腐殖土的盆中。放置于通风、散光的环境中进行正常的栽培管理，保持环境温度为22～24 ℃，空气湿度在60%～80%。

1.7  数据统计

利用Excel统计数据，运用 SPSS Statistics 24.0对数据进行方差分析。不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

2  结果与分析

2.1  不同消毒时间对二倍体苍白茎藜种子发芽的影响

由表3可知，处理①的外植体污染率最高，为55.56%，而处理②和处理③随着消毒时间的延长，外植体的污染率降至0，发芽率也下降，但是各处理间发芽率无显著差异（P>0.05），因而，外植体的最佳消毒时间为6 min 2%次氯酸钠溶液。

2.2  不同植物生长调节剂配比对愈伤组织诱导的影响

将

培育的二倍体苍白茎藜无菌苗茎段接种到含有不同浓度

6-BA、NAA和2，4-D的培养基中，由表4可知，处理A1、处理A2未能诱导出愈伤组织，处理A6诱导率达到64.97%，愈伤组织呈浅黄色，处理A7诱导率降低。处理A12培养基的诱导率达到83.57%，处理A13培养基诱导率降低，出现抑制现象。当6-BA、NAA和2，4-D浓度均为1.0 mg/L时，处理A14诱导率达到最高86.63%，愈伤组织呈浅黄色，结构疏松，继代后愈伤组织为胚性愈伤（图1 A），后期能够分化出绿色芽点；处理A15培养基诱导率降低为56.67%，愈伤组织水渍化严重（图1 B）。由此可知，适当NAA、2，4-D浓度能促进愈伤组织诱导，浓度过高则会抑制。多种激素处理更有利于诱导愈伤组织的诱导，其愈伤组织最佳诱导激素配比为A14处理，即MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D。

2.3  不同植物生长调节剂配比对愈伤组织不定芽诱导的影响

在最适培养基上进行愈伤组织的继代，浅黄色呈颗粒状的愈伤组织繁殖速度快，但是诱导器官发生能力极低。挑选长势良好、松软的愈伤组织，转接到添加不同浓度的NAA、6-BA、2，4-D、KT、ZT、TDZ及2-IP的不定芽再分化培养基上（表2）。在B1～B7培养基中，仅B2培养基能成功诱导愈伤组织再分化形成不定芽（图1C），再分化率为11.67%，同时也诱导愈伤组织分化出不定根（图1D），不定根的分化率为60.00%，比不定芽的分化率高（表5）。

2.4  诱导生根及移栽

把2～3 cm高的不定芽接种到含有不同浓度的IBA与NAA的培养基中，进行生根诱导（表6）。在不含有激素的MS的C1处理与1/2MS的C2处理中，生根率分别为73.33%和76.67%。C1和C2处理生根率间无显著差异（P>0.05）。IBA单独处理时，随IBA浓度增大，生根率逐渐升高，在2.0 mg/L IBA C7处理时诱导率高达100%。而单独添加0.1 mg/L NAA的C8处理生根率为90.00%。然而，IBA与NAA共同添加的C9处理的生根率也高达100%（图1E）。可见，IBA与NAA共同添加具有增效的作用。因而，苍白茎藜的最佳生根培养基为C7或C9。生根后的苍白茎藜幼苗在大棚内开瓶炼苗5～7 d后移栽至基质盆中（图1F），生长30 d后，形成长势健壮的二倍体苍白茎藜幼苗（图1G）。