三角鲤线粒体基因组全序列测定及分析

摘要  ［目的］三角鲤（Cyprinus multitaeniata）是我国具有重要经济价值的鱼类之一，了解三角鲤线粒体基因的结构和特点，为三角鲤的种群遗传多样性研究提供基础资料。［方法］采用26对引物扩增三角鲤的线粒体全基因，通过生物软件识别和分析各基因和非编码序列的位置和特点，并通过与GeneBank数据库已发表鲤科鱼类序列进行比较和构建系统发育树进行分析。［结果］三角鲤线粒体全基因总长度为16 573 bp，碱基含量A为32.2%、T为24.9%、C为27.3%、G为15.6%；包括37个编码基因（编码蛋白基因13个、tRNA基因22个和rRNA基因2个）和2个非编码序列区（OL区和控制区）。13个蛋白编码基因中，COX1的起始密码子为GTG，其他均为ATG；终止密码子包括TAG（ATP8）、TA（COX3、ATP6）、T（ND2、COX2、ND3、ND4、Cty b）和TAA（ND1、COX1、ND4L、ND5、ND6）3种。22个tRNA基因中，除了tRNASer（AGC）外其余都能折叠成典型的三叶草结构；三角鲤控制区序列可以识别出3个典型保守区域；系统发育分析表明，三角鲤与大眼鲤（C. megalophthalmus）亲缘关系较近。［结论］三角鲤线粒体基因组成、长度和排列顺序与典型的脊椎动物相同，在亲缘关系上与大眼鲤最近；线粒体基因组序列适用于三角鲤的系统发育分析。

关键词  三角鲤；线粒体基因组；全序列分析；系统发育

中图分类号  S917.4  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）05-0108-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.05.026

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Sequencing and Analysis of Complete Mitogenome of Cyprinus multitaeniata

LI Qiang， LI Wen-jun， HAN Chong et al

（College of Life Science， Guangzhou University， Guangzhou， Guangdong 510006）

Abstract  ［Objective］Cyprinus multitaeniata is one of the important economic fish in China. Understanding the structure and characteristics of complete mitogenome of Cyprinus multitaeniata， to provide a scientific basis for the protection and utilization of its germplasm resources. ［Method］In this study， 26 pairs of primers were used to amplify the complete mitochondrial gene of C. multitaeniata. The position and characteristics of each gene and non-coding sequences were identified and analyzed by softwares. The sequence of C. multitaeniata was compared with the published sequences of Cyprinidae in GeneBank database and the phylogenetic tree was constructed. ［Result］The total length of mitogenome of C. multitaeniata was 16 573 bp， and the base contents of A， T， C， and G were 32.2%， 24.9%， 27.3%， and 15.6%， respectively. There were 37 coding genes （22 tRNA genes， 13 coding protein genes， and 2 rRNA genes） and 2 noncoding sequence regions （OL and control regions） in the complete mitogenome C. multitaeniata. The start codon of 13 protein coding genes was ATG except for COX1 which was GTG. Stop codons included TAG （ATP8）， TA （COX3， ATP6）， T （ND2， COX2， ND3， ND4， Cty b） and TAA （ND1， COX1， ND4L， ND5， ND6）. All the 22 tRNA genes except tRNASer （AGC） folded into the typical clover structure. Three typically conserved regions could be identified in the control region of C. multitaeniata. Phylogenetic analysis showed that the C. multitaeniata was closely related to the C. megalophthalmus. ［Conclusion］The composition， length， and sequence of mitochondrial genes of C. multitaeniata were similar to those of typical vertebrates， and it is the closest to C. megalophthalmus in genetic relationship. The mitochondrial genome sequence is suitable for phylogenetic analysis of the C. multitaeniata.

Key words  Cyprinus multitaeniata;Mitochondrial genome;Complete sequence analysis;Phylogeny

基金项目  广州市科技计划项目（201804010486）；广东省教育科学规划课题（2021GXJK097）。

作者简介  李强（1983—），男，广东韶关人，实验师，博士，从事淡水鱼类生态与亲缘地理研究。

*通信作者，讲师，博士，从事生物技术研究。

收稿日期  2023-05-13；修回日期  2023-06-25

三角鲤（Cyprinus multitaeniata Pellegrin et Chevey，1936），俗称江鲫、黄板鲤、黄鲫，隶属于鲤形目（Cypriniformes），鲤科（Cyprinidae），鲤属（Cyprinus），为重要的经济鱼类。其主要分布于西江水系和元江水系。目前，关于三角鲤的研究主要集中于饲料营养［1-2］、人工繁育［3-5］等方面，但对于三角鲤线粒体基因分析的研究鲜见报道。

鱼类线粒体基因具有序列结构及排列比较简单、缺少基因重组、母系遗传和进化速率快等特点［6］，线粒体基因组组成相对稳定，但基因结构和排列顺序具有一定差异，且这些差异能反映不同进化路线，在生物间系统起源、演化、分类及亲缘关系等研究中被广泛应用［7］。笔者拟对三角鲤线粒体基因组特征进行分析，并与其他鲤科鱼进行比较，从而进一步在分子的水平上研究亲缘关系及其分类地位，旨在为三角鲤遗传育种及种群资源利用和保护提供相关理论依据。

1  材料与方法

1.1  试验材料

试验用三角鲤样品，采自西江水系的南宁市区域，样品用95%乙醇固定后于-20 ℃保存。

1.2  DNA提取与扩增

基因组DNA提取采用试剂盒（生工生物工程股份有限公司，上海）。PCR扩增采用自行设计的26对引物进行（表1）。PCR反应体系包括5 μL 10×Buffer（含Mg2+）、1.5 μL dNTPs（各10 mmol/L）、0.8 μL Taq酶（5 U/μL）、上下游引物各2 μL（10 μmol/L）、3 μL DNA模板，加水至总体积50 μL。反应条件：94 ℃预变性5.0 min，94 ℃变性1.0 min，50～55 ℃复性1.0 min，72 ℃延伸1.5 min，35个循环，延伸10.0 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测合格后，委托上海生工生物工程有限公司进行纯化并测序。

1.3  数据分析

采用DNAstar 5.0和MEGA 6.0软件对所测得序列进行比对校正和拼接；通过MITOS WebServer BETA软件识别并确定13种蛋白编码基因的位点；利用tRNAscan-SE1.21识别出三角鲤的22个tRNA基因和rRNA基因。通过对比其他鲤科鱼类的控制区序列，对三角鲤控制区结构进行分析；根据tRNAAsn和tRNACys，识别出OL区的长度与位置，通过RNA Structure软件模拟OL二级结构。利用MEGA 6.0软件统计三角鲤线粒体基因组序列组成情况。从GeneBank数据库下载鲤属鱼类和临近的鲫属、倒刺鲃属共24种鱼类的线粒体基因组序列，以泥鳅为外类群，截取重链上的12个蛋白编码基因的核苷酸序列，进行系统进化树分析。25种鱼类线粒体基因组信息见表2。

2  结果与分析

2.1  结构与组成

三角鲤线粒体基因组全序列长度为16 573 bp，包括蛋白编码基因13个、tRNA基因22个、rRNA基因2个、OL区和控制区。其中，23个基因位于重链（H链），包括14个tRNA基因、12个蛋白编码基因和2个rRNA基因；其他9个编码基因（包括tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNAtyr、tRNASer（UCA）、tRNAGlu、tRNAPro、ND6）都分布轻链（L链）上（表3）。

三角鲤的线粒体基因组碱基含量分别为：A为32.2%、T为24.9%、C为27.3%、G为15.6%，A+T含量（57.1%）明显高于C+G含量（42.9%），表现为A+T偏好性。这与脊椎动物偏好于A和T碱基是一致的。

2.2  编码基因

三角鲤线粒体基因组中，除ND6基因的分布在L链，其余12个蛋白编码基因均位于H链。除COX1的起始密码子为GTG外，其他12个蛋白编码基因起始密码子均为ATG；除了ATP8终止密码子为TAG，COX3、ATP6的终止密码子为TA，ND2、COX2、ND3、ND4、Cty b的终止密码子为T，其余蛋白编码基因终止密码子为TAA（表3）。

在22个tRNA中，长度为67～77 bp。其中21个都能折叠成典型的三叶草结构，tRNAser（AGC）由于缺少二氢尿嘧啶臂（D臂）未能形成三叶草结构［8］，这与其他鲤科鱼类情况类似。12S rRNA的基因长度为954 bp，16S rRNA的基因长度为1 679 bp。

2.3  非编码序列

在tRNAAsn与tRNACys之间有一段非编码序列，长度为33 bp，被称为L链复制起始区，又称为OL区。利用RNA Structure 5.2 模拟绘制出OL区的二级结构，OL区能形成稳定的茎环结构，包括由8对碱基组成的茎区，其序列为TTCCCGCC/AAGGGCGG，还有14 bp构成的环区。OL茎区中具有8对碱基，有6对为G-C碱基，这种二级结构的特征与其他硬骨鱼类相似。