近三倍非整倍体紫锥菊的染色体加倍

摘要  ［目的］建立高效的紫锥菊（Echinacea purpurea L.）非整倍体离体诱导加倍的方法，为紫锥菊育种和遗传学研究提供创新性种质。［方法］采用离体诱导方法，比较4个紫锥菊近三倍非整倍体株系（C31，2n=31；C32-1，2n=32；C32-2，2n=32；C34，2n=34）在不同前处理持续时间、不同秋水仙素处理浓度和处理持续时间条件下的加倍诱导效果的差异。［结果］4个非整倍体株系的染色体加倍效果均随预处理时间的延长、秋水仙素处理浓度的提高及处理时间的延长而呈先上升后下降的趋势，并分别在预处理4 d、秋水仙素浓度120 mg/L、处理时间25 d时，获得最佳的诱变效果。根据根尖染色体计数鉴定的结果，由近三倍非整倍体C31、C32-1、C32-2、C34株系加倍获得的近六倍非整倍体染色体数目分别为2n=62、2n=64、2n=64、2n=68，其植株形态与原植物相比，均表现为生长缓慢，植株矮化，叶片增厚、反卷、脆硬，叶表皮毛茸增长、加密，叶柄缩短，生根缓慢，根短而粗，侧根少甚至无等特点。［结论］秋水仙素可成功诱导近三倍非整倍体紫锥菊加倍成为近六倍的高倍非整倍体；秋水仙素诱导的非整倍体染色体加倍和整倍体相同，即每条染色体都实现了加倍，不受非整倍体中各号染色体原来数量不尽相同所影响。

关键词  近三倍非整倍体；近六倍非整倍体；紫锥菊；染色体加倍

中图分类号  S682.1+1  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）05-0189-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.05.045

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Chromosome Doubling of Near-triplex Aneuploids in Echinacea purpurea

LI Xing-lian1， JIANG Wei-zhen2， DAI Qian1 et al

（1.College of Life Sciences，South China Agricultural University， Guangzhou，Guangdong 510642;2.College of Traditional Chinese Medicine Resources， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou，Guangdong 510006;3.Southern Medicine Research Institute of Yunfu，Yunfu，Guangdong 527300）

Abstract  ［Objective］To establish effective methods for inducing chromosome-doubling of aneuploids in E. purpurea， and provide innovated germplasm for breeding and genetic study of E. purpurea.［Method］In vitro methods were used for comparing the effects of different pre-culture treatment duration， concentrations of colchicine for the treatment and the treating duration on the induction of chromosome doubling among four lines of near-triplex aneuploids of E. purpurea （C31， 2n=31;C32-1， 2n=32， C32-2，2n=32;C34， 2n=34） .［Result］The chromosome doubling effects of the four aneuploid lines were all showed a trend of first increasing and then decreasing with the increase of pre-culture treatment duration， colchicine concentration and treatment duration， and the conditions of 4 days pre-culture treatment， treatment with 120 mg/L colchicine for 25 days were suitable for induction of chromosome doubling of the four near-triplex aneuploids.According to the results of root tip chromosome counting identification， chromosome numbers counted in the root tip cells of the near-hexaploid aneuploids obtained by doubling strains C31， C32-1， C32-2 and C34 were 2n=62， 2n=64， 2n=64 and 2n=68， respectively， and the morphology of all near-hexaploid compared with its original plant， was characterized by slow growth， dwarfing， leaf blade thickening， revolute， brittle and hard， leaf epidermal hairs growth， shortened petiole， slow rooting， short and thick roots， few or no lateral roots， etc.［Conclusion］Near-triplex aneuploids could be induced to double the chromosome numbers and became near-hexaploid aneuploid by the treatment of colchicine in vitro， and the results were just like that of euploids. That is to say， all the chromosomes were doubled with no affects from the differences in the chromosome numbers in the original aneuploids.

Key words  Near-triplex aneuploid;Near-hexaploid aneuploid;Echinacea purpurea;Chromosome doubling

基金项目  云浮市科技局产学研科技攻关项目（2021A090201）。

作者简介  黎幸连（1988—），女，广东江门人，硕士研究生，研究方向：紫锥菊种质资源创制。*通信作者，研究员，博士生导师，从事紫锥菊种质资源创制及新品种选育研究。

收稿日期  2023-04-15

紫锥菊（Echinacea purpurea L.）为原产于美洲的一种菊科（Asteraceae）松果菊属（Echinacea）多年生草本植物［1］，因其在抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、免疫强化、抗菌消炎等方面具有良好的药用功效而稳居世界销量最大的植物源药材前3位［2-5］。紫锥菊属于虫媒异花授粉植物，且自交不亲和，因其后代杂合性高，不同基因型的紫锥菊表型各异，有效成分含量参差不齐，导致其药材、制剂质量不稳定，经济效益低［6-8］。在自然界中，多倍体不仅是物种形成与进化的主要途径之一［9-11］，同时也是育种工作中提高作物品质和产量的重要手段之一。大量的研究发现，在多倍体形成的初期，往往因减数分裂异常配对或不均等分离而产生一定比例的非整倍体个体［12-15］。例如，在拟南芥（Arabidopsis  thaliana）中，其三倍体、异源四倍体和同源四倍体的自交后代中，均可观察到大量的可育非整倍体个体［12，16-18］。在新合成的异源四倍体油菜早期世代中同样发现了大量的包括染色体结构变异和数目变异的非整倍体个体［13］；在异源六倍体小麦形成初期，随着植物物种倍性的增加，非整倍体出现的频率也随之提高［19］。这些研究结果表明植物多倍化不仅是产生非整倍体的基础之一，同时倍性的增加也增强了其基因组对非整倍体的耐受性，提高获得非整倍体的概率，增加获得非整倍体的类型。

非整倍体是指生物有机体的染色体组由于增加或减少一条或若干条染色体，或者片段染色体的获得或丢失，而形成的染色体组不平衡的个体或群体。研究表明，这种一条或若干条染色体剂量的改变易对生物个体产生显著的表型变异［12，20-21］。有研究发现，曼陀罗的每一种类型的初级三体所呈现的果实形态均略有不同［22］；拟南芥1号、3号、4号、5号染色体剂量的改变对其茎的直径、空腋率以及莲座叶产生显著影响［12］；普通烟草每一种单体与正常双体相比，其花冠和植株大小、发育速度、叶形以及叶绿素浓度等都产生了显著的表型变异［23］；在紫锥菊中，染色体数目接近于三倍体的非整倍体个体（2n=31、32、34）与正常三倍体相比，其花期、花茎硬度、叶绿素含量、植株干重以及有效成分含量等均产生了显著变化［24］。Li等［25］研究发现，在紫锥菊二倍体与三倍体杂交后代中，染色体数目介于二倍体与三倍体之间的部分非整倍体的有效成分含量显著高于其亲本植株，其中非整倍体A2（2n=24）的菊苣酸含量是其亲本二倍体和三倍体的近3倍。这些结果表明通过人工调控植物若干染色体的剂量水平，可实现优异农艺性状的品种改良，为植物育种工作提供了新思路。

截至目前，通过人工诱导的方法先后获得了紫锥菊单倍体［26］、四倍体［27］、六倍体［28-29］、八倍体［30］，并通过二倍体与三倍体杂交获得大量染色体数介于二倍体与三倍体之间的可育的、形态发育正常的非整倍体个体，其中部分非整倍体的有效成分含量显著高于其亲本植株［25］。然而，有关非整倍体紫锥菊的加倍诱导以及获得有活力的高倍性非整倍体等相关方面的研究目前鲜见报道。因此，该研究以同源四倍体紫锥菊与二倍体杂交获得的染色体数目接近于三倍体的非整倍体为材料，采用离体诱导的方法，探讨秋水仙素不同处理浓度、处理时间以及预处理时间对非整倍体紫锥菊加倍效果的影响，为获得各种类型核型组成的高倍性非整倍体紫锥菊及其品种改良提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  试验材料

该试验以二倍体和四倍体紫锥菊杂交鉴定获得的近三倍非整倍体个体的无菌苗为诱导材料，其原始二倍体种子购自美国马萨诸塞州诺顿一家名为Plantation Products的园艺公司。

1.2  试验方法

1.2.1  无菌材料的繁殖。

将鉴定获得的近三倍非整倍体无菌苗C31、C32-1、C32-2、C34在无菌条件下切取叶柄，接种于繁殖培养基上（MS +0.3 mg/L BA+0.01 mg/L NAA+0.1 g/L 肌醇+30 g/L 蔗糖+4.5 g/L 琼脂，pH=5.8），于温度为（25±1）℃、光照强度为 1 000 lx、光照时间为 12 h 的条件下培养45 d，获得大量的无菌苗作为多倍体诱导材料。

1.2.2  诱导方法。

将在无菌条件下切取的近三倍非整倍体植株的叶柄接种于不含秋水仙素的再生培养基上（MS +0.4 mg/L BA+0.01 mg/L NAA+0.1 g/L 肌醇+30 g/L 蔗糖+5.0 g/L 琼脂，pH=5.8）预处理0～8 d（每2 d为一个时间梯度）后，将外植体转接至添加120 mg/L秋水仙素的再生培养基上进行诱导培养25 d；将预处理4 d后的叶柄外植体转接至添加不同浓度秋水仙素（0、40、80、120、160、200 mg/L）的再生培养基上进行诱导培养25 d；将预处理4 d的叶柄外植体转接至添加120 mg/L秋水仙素再生培养基上进行诱导培养0～35 d（每5 d为一个时间梯度）。培养温度为 （25±1）℃，光照强度为 1 000 lx，光照时间为12 h。

1.2.3  诱导不定芽再生。