重金属汞胁迫下菲律宾蛤仔GPx和GST基因表达分析

摘要 为研究重金属汞胁迫下菲律宾蛤仔谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）和谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase，GST）基因的表达情况，用汞对指示生物菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）进行单一慢性暴露试验，分别在0、12、24 h以及2、3、4、5、6、7和8 d时检测菲律宾蛤仔内脏团和鳃中GPx和GST基因的表达情况。结果表明，菲律宾蛤仔内脏团中GPx和GST基因的表达量都呈现波动变化趋势，分别在24和12 h时表达量最高（P<0.05），6 d时GPx基因表达量最低（P>0.05），3 d时GST基因表达量最低（P<0.05）；GPx基因在鳃中的表达量在8 d时最高（P<0.05）；鳃中GST基因的表达量在5 d时最高（P<0.05）。以上结果表明汞暴露在短期内能够诱导GPx和GST基因进行不同程度的表达，但其随着时间的延长呈明显的抑制作用。该研究结果为揭示重金属汞对菲律宾蛤仔的毒性机理提供了理论依据。

关键词 重金属汞；菲律宾蛤仔；谷胱甘肽过氧化物酶；谷胱甘肽-S-转移酶

中图分类号 S917.4  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）10-0113-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.10.024

Expression Analysis of GPx and GST Genes in Ruditapes philippinarum Under Heavy Metal Mercury Stress

ZHENG Zhi-long1，2， YAN Lu-lu1，2， YAN Xi-wu1，2 et al

（1.College of Fisheries and Life Science， Dalian Ocean University， Dalian， Liaoning 116023;2.Liaoning Shellfish Breeding Engineering Technology Center， Dalian，Liaoning 116023）

Abstract In order to study the gene expression of glutathione peroxidase （GPx） and glutathione-S-transferase （GST） in Ruditapes philippinarum under the stress of heavy metal mercury （Hg），  a single chronic exposure experiment on the indicator organism R. philippinarum was carried out. The expression of two genes in visceral mass and gill of  R. philippinarum was detected at 0，12 h，24 h and 2， 3， 4， 5， 6， 7 and 8 d. The results showed that the expression multiples of GPx and GST in the visceral mass showed a fluctuation trend， and the expression multiples reached the highest （P<0.05） at 24 and 12 h， respectively. The expression level was the lowest at 6 d（P>0.05）and 3 d （P<0.05）. The expression multiple of GPx in the gill was the highest at 8 d （P< 0.05）， and the first peak appeared at 5 d. The expression amount of GST  was the highest at 5 d （P<0.05）. It showed that mercury exposure could induce the expression of GPx and GST in different degrees in the short term，but it had obvious inhibitory effect with the extension of time. This study provided the theoretical basis for revealing the toxicity of heavy metal mercury to R. philippinarum.

Key words Heavy metal mercury;R. philippinarum;Glutathione peroxidase;Glutathione-S-transferase

基金项目 山东省重点研发计划项目（2023LZGCQY001）；现代农业产业技术体系专项（CARS-49）；国家重点研发计划项目（2018YFD0901400）。

作者简介 郑志龙（1999—），男，福建福州人，硕士研究生，研究方向：水产动物遗传育种与繁殖。

*通信作者，教授，博士，从事水产养殖学研究。

收稿日期 2023-04-21

随着城市化发展的不断加快，大量城市污水和固体废弃物直接排入水中，致使重金属污染严重破坏海洋生态系统平衡，已引起广泛关注。重金属污染物（Hg、Cd、Pb、Cr、Cu、Zn等）流动性低、难以降解且难溶于水，但来源十分广泛，残留时间久并通过食物链被生物富集和传递，最终汇入海洋造成不可逆转的伤害，严重危及人体健康［1］。

重金属汞已成为全球关注的持续性污染物，被列为污染物优先排查的控制目标［2］。重金属汞进入海洋无法降解，只能通过颗粒沉降进入沉积物才能离开海洋，但沉积物中有机组分矿化及生物扰动会促使汞释放出来重新进入水体［3］。在此过程中其对底栖生物又造成了危害，继而造成二次污染，危害海洋生物。

金属的毒性作用已经在许多水生生物中被证实［4］。双壳贝类最具代表性，其金属中毒的主要后果是氧化应激［5］。大量研究表明，金属中毒促进了生物体内活性氧（ROS）的生成，进而导致细胞过氧化损伤、脂质过氧化等［6］。为了减少活性氧对生物的影响，生物体内启动有效的抗氧化防御机制，主要包括谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）和谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase，GST）［7］。因此，对抗氧化反应和脂质过氧化水平的评价常常被应用于双壳贝类在重金属暴露环境的研究中［8］。谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）通过将内源性活性氧维持在相对较低水平来保护细胞免受氧自由基的损害，并减轻其应激反应相关的损害［9］。谷胱甘肽-S-转移酶（GST）是一种Ⅱ期解毒酶，参与有机化合物的结合和解毒，通过催化谷胱甘肽过氧化物酶的活性，发挥抗氧化应激的保护作用［10］，因此它被认为是监测海洋海岸生态系统金属污染的生物标记物［11］。

我国是海水养殖大国，贝类是四大海水养殖产品之一。其中，菲律宾蛤仔在水体中分布广泛，对多种重金属（Cd、Zn、Cu、Hg和Cr等）有较高的富集能力，因此菲律宾蛤仔不仅被用于重金属污染监测，而且在海洋毒理学研究中被广泛应用［12］。针对重金属汞的海洋生态毒理学研究，一般包括生长、呼吸、行为、繁殖、滤食和发育等方面［13］。为了保护海洋生物免受汞的毒害，要加强对重金属汞的防治和控制，明确重金属汞对海洋生物的毒性效应。笔者选取谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）这2个与谷胱甘肽代谢相关的关键基因，通过实时荧光定量PCR方法验证和分析这2个基因

在汞胁迫下菲律宾蛤仔体内的表达情况，旨在为揭示重金属汞对菲律宾蛤仔的毒性机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验动物为菲律宾蛤仔，购于大连长兴市场（进货渠道为大连庄河周边养殖场），壳长（3.0±0.5）cm，个体健壮，生活状态良好。

1.2 试验药品

动物组织总RNA提取试剂盒（柱型），购自天根生化科技（北京）有限公司；

SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ Kit，购自宝生物工程（大连）有限公司；

PrimeScriptTM RT reagent Kit，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 主要仪器与设备

核酸蛋白检测仪，为德国Implen NanoPhotometer公司产品；

荧光定量检测系统Mx3005p，为美国Agilent Stratagene公司产品；

梯度PCR仪，为德国Eppendorf公司产品；

电泳仪，为北京六一仪器厂产品；

生物电泳图像分析系统，为上海天能科技有限公司产品；

高速冷冻离心机，为德国Hettich公司产品。

1.4 试验方法

1.4.1 汞胁迫下菲律宾蛤仔表达谱研究。

1.4.1.1

测序与序列比对。将经0.094 8 mg/L Hg处理的菲律宾蛤仔分别在0、12 h和6 d时取其鳃和内脏团，并迅速放入液氮中保存。采用Invitrogen公司的Trizol试剂提取RNA；提取RNA后，按照Invitrogen公司的Dynabeads mRNA纯化试剂盒进行mRNA的纯化。将mRNA在fragmentation buffer提供的高盐理性环境下，高温打断；以打断的mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成cDNA第一链，加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase Ⅰ合成cDNA第二链；经过QiaQuick PCR纯化试剂盒纯化并加入EB缓冲液洗脱，末端修复、加碱基A后加上测序接头，再经过琼脂糖凝胶电泳回收目的片段大小的核酸序列，进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作，构建的文库用Illumina HiSeqTM 2000测序仪进行测序。测序仪产生的原始图像数据经base calling转化为序列数据，序列数据包含reads的序列及reads的测序质量，原始reads数据中带有含测序接头的序列和少量低质量序列；最后，利用SOAPaligner/Soap2软件，将每个样品的clean reads分别与菲律宾蛤仔转录组进行比对，最后将比对得到的基因用于后续生物信息学分析。

1.4.1.2 生物信息学分析。对clean reads进行测序评估，并根据clean reads比对到参考序列（菲律宾蛤仔转录组）上的数量及分布，采用RPKM法（reads per kilobase per million）计算该基因的表达量，计算公式如下：

RPKM（A）=106CNL/103（1）

式中：RPKM（A）为A基因的表达量；C为唯一比对到A基因的reads数；N为唯一比对到参考基因的reads数；L为A基因的碱基数。