河南口岸进口绿豆截获的伪粗野粉蝇鉴定

摘要 ［目的］应用形态学分类和DNA条形码技术鉴定入境绿豆中截获的雌性蝇类。［方法］2023年2月23日，从装载乌兹别克斯坦绿豆的集装箱中截获1只丽蝇科雌虫，对其进行DNA条形码和形态鉴定，并与近似种粗野粉蝇进行形态和条形码比较。［结果］此次截获蝇类为雌性伪粗野粉蝇，为河南口岸首次截获。［结论］应用DNA条形码与形态分类相结合的方法可以准确快速鉴定蝇类。

关键词 粗野粉蝇；伪粗野粉蝇；DNA条形码；形态鉴定

中图分类号 S41-3  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）14-0066-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.14.014

Identification of Pollenia pediculate from Imported Mung Bean in Henan Port

ZHANG Fang，DANG Zhi-hao，MIAO Xiao-xing et al

（Zhengzhou Customs， Zhengzhou， Henan 450000）

Abstract ［Objective］ To identify the female fly intercepted from imported mung bean by morphological classification and DNA barcoding techniques. ［Method］ A female fly which were intercepted from mung bean on an container from Uzbekistan at Henan Port  on February 23， 2023. And it was identified by using morphological classification and DNA barcoding techniques， and it was compared with its similar species Pollenia rudis. ［Result］ The intercepted fly was identified as Pollenia pediculate， female.It was intercepted for the first time at Henan Port. ［Conclusion］ Flies could be identified rapidly and accurately by using DNA barcoding and morphological classification.

Key words Pollenia rudis;Pollenia pediculate;DNA barcoding;Morphology identification

基金项目 河南省科技攻关项目（222102110410）。

作者简介 张芳（1985—），女，河南尉氏人，兽医师，硕士，从事媒介生物学研究。*通信作者，农艺师，硕士，从事外来入侵物种研究。

收稿日期 2023-05-17

2023年2月23日，从郑州车站海关入境的装载乌兹别克斯坦绿豆的集装箱中截获1只丽蝇科雌虫，将其制作成针插标本，通过形态鉴定和DNA条形码技术与实验室已截获标本粗野粉蝇（拉丁学名Pollenia rudis，2016年4月从俄罗斯4B6485货舱截获）进行DNA条形码和形态比较，确定其为伪粗野粉蝇（Pollenia pediculata），雌性。经查阅文献可知，该种在宁波、中山等口岸均有被截获记录［1-2］，但在河南并未有该蝇种的截获记录，从入境粮食中截获该虫为河南口岸首次。笔者利用分子生物学手段结合传统形态学分类来鉴定该蝇种，并防止其携带病原体造成扩散，以期为后期在实际工作中有效鉴别伪粗野粉蝇奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用样本为2023年2月23日在郑州车站海关入境的乌兹别克斯坦绿豆中截获活体雌性丽蝇科成蝇1只，将其制作成标本，保存在郑州海关媒介实验室。

1.2 形态鉴定

依据《中国蝇类》检索表［3］，使用基恩士V-5000超景深显微镜进行形态学鉴定，并对其形态特征进行描述。

1.3 DNA条形码鉴定

DNA提取试剂盒购自凯杰公司，Taq酶购自大连某公司；取标本后足1条，按照凯杰公司DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，于-20 ℃下保存备用。蝇类COI扩增引物F（COI 1490）为5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，扩增引物R（COI 2198）为5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′，由英杰公司合成。PCR反应体系（25.0 μL）如下：10 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，Premix TaqTM 酶12.5 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL，混匀后进行PCR扩增。PCR反应条件：94 ℃3 min；94 ℃ 40 s，51 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。利用毛细管电泳检测PCR产物大小。

1.4 序列比对分析和发育树构建

扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司郑州测序部进行测序。用 SeqMan软件［4］判断COI基因序列峰图质量。去掉两端引物拼接后获得全长658 bp的序列，用于后续分析；用EditSeq软件对所得序列进行碱基成分分析。选取亲缘关系较近的5条序列，以丝光绿蝇、反吐丽蝇和红头丽蝇为外群，共计9条序列使用Mega 7.0［5］软件，选取邻接法（neighbor-joining algorithm method，简称NJ法）、最大似然法（maximum likelihood method，简称ML法）、最小进化法（minimum-evolution method，简称ME法）和最大简约法（maximum parsimony method，MP法）构建分子系统发育树，bootstrap test值选择1 000，结合形态学和条形码鉴定结果确定该蝇种。

2 结果与分析

2.1 形态学结果

此次截获蝇类的形态观察见图1。为方便后续实际工作中能快速鉴别该蝇种，现将该蝇种形态特征描述如下：该蝇种为雌性，体长8.0 mm左右，额鬃列外侧有3行黑色小毛，头部额和颜高约等，侧额大于间额，头前端粉被为金黄色，颊、后头毛黑色，颊后方与下后头覆黄毛，颊高达眼高1/2处，侧颜宽侧颜下端和下侧颜红棕色，且大部具毛。中颜板处覆盖灰色粉被且略陷入，颜脊狭，新月片、鞭节为棕黄色，鞭节外侧及前方黑色，颜堤下半部分为红棕色，基部和内侧为棕黄色，梗节为鞭节的1/2，触角短，触角芒长羽状，下侧纤毛较短。下颚须为褐色。

胸：黑色，前盾前段覆金黄色薄粉被。胸部黄色绵毛被易擦落，胸部刚毛黑色。前中鬃和背中鬃2，后中鬃和背中鬃3，肩鬃3，肩后鬃2，翅后坡和小盾片下面均覆有黄色绵毛被，翅内鬃1+2。下侧鬃为6根。小盾片近边缘为黑色毛，后小盾片不凸出。前胸侧板中央凹陷无毛，前胸基腹片凹陷处裸，翅下大结节无毛，腹侧片鬃1∶1。

前缘基鳞为棕黄色，翅前缘刺明显且短，亚前缘骨片分布有小刚毛，肩横脉与亚缘脉（hc-sc）结节腹面处具明显淡色毛。m1+2脉呈角形弯曲，2R5室开放狭，约为r-m横脉的1/3，r4+5脉基段1/2腹面具小刚毛。翅下腋瓣上面裸，黄白色。平衡棒黄色。

足呈黑色，各足股节基部均无黄毛。腹板和足中后股后面及后腹面着生黑色毛。前股后腹鬃1背鬃7；前胫后腹鬃2前背鬃6；中股前腹鬃1，后腹面仅基部有鬃列；后胫前腹面具少量倒伏黑色纤毛。

腹呈卵形且略带暗棕色，覆有明显灰被斑。背板腹面仅具黑色毛，第6背板短，第7背板中间膜状部分比骨化部分宽。

为了区别相似种，将实验室已截获的粗野粉蝇（Pollenia rudis）和此次截获样本进行了形态比较，结果见图2。从图2可以看出，截获蝇类肩横脉与亚缘脉结节腹面有淡色毛，后胫前腹面仅具倒伏毛，中、后股具后腹鬃；粗野粉蝇亚缘脉与肩横脉结节腹面无毛，后胫前腹面具大量长的直立纤毛，中、后股后腹面通常具黑毛。

地理分布：国外主要分布在大洋洲（新西兰）；非洲（南非）；北美洲（加拿大、巴哈马群岛、美国）；欧洲（安道尔共和国、亚美尼亚 、葡萄牙、罗马尼亚、俄罗斯、斯洛伐克、西班牙）；亚洲（南斯拉夫、沙特阿拉伯、印度、巴基斯坦）。国内主要分布在新疆、上海、浙江等地［6］。

生态习性：该属部分蝇类为传粉昆虫。伪粗野粉蝇的幼虫能寄生蚯蚓，其成蝇一般3—10月份可在猪圈、草地、树林、菜地等生境中采集到，偶尔也可在冬季发现。在北美和北欧其数量高峰期出现在早春，采获成蝇地区海拔可达2 500 m［7］。

2.2 测序结果分析

测序序列经过两端引物掐除，获得658 bp大小的目的序列。该序列分别在GenBank和Bold Systems v4上比对，发现截获蝇类序列与GenBank中公布的伪粗野粉蝇（登录号GU689853.1）COI序列相似度为100%，将测得的序列上传至GenBank，获得序列登录号为OQ826444；在Bold Systems v4中显示结果也是100%的伪粗野粉蝇（图3）。

碱基成分分析结果显示，T、A、C、G含量分别为38.50%、28.60%、16.00%、16.90%；A+T碱基的含量高达67.10%，G+C碱基含量为32.90%。此次碱基成分分析结果与昆虫线粒体DNA中A+T含量偏高的结论［8-10］相符。

2.3 系统发育树分析

利用Mega 7软件对所测样本序列、实验室已知粗野粉蝇序列和亲缘关系较近、同属于粉蝇属的6条序列，以丽蝇科丝光绿蝇、反吐丽蝇和红头丽蝇为外群，共计9条序列，选取邻接法（neighbor-joining algorithm method，简称NJ法）、最大似然法（maximum likelihood method，简称ML法）、最小进化法（minimum-evolution method，简称ME法）和最大简约法（maximum parsimony method，简称MP法）构建分子系统发育树。由图4～7可知，试验样本序列（GenBank登录号为OQ826444）和伪粗野粉蝇［Pollenia hungarica（GU68853.1）］聚在一起，置信度为100%，与匈牙利粉蝇（Pollenia hungarica）、游荡粉蝇（Pollenia vagabunda）、窄颊粉蝇（Pollenia angustigena）、粗野粉蝇（Pollenia rudis）共同聚成粉蝇属，粉蝇属和其他外群分开，条形码判定该蝇为伪粗野粉蝇。

3 讨论

病媒生物可携带乙型脑炎病毒、登革病毒、寨卡病毒、黄热病毒、鼠疫杆菌、霍乱弧菌等，给我国人民身体健康带来严重危害［11］。粉蝇属的成虫是重要的传粉者，因此得名Pollenia，但粉蝇属蝇类尸体的堆积会引起人过敏，尸体可能成为皮鼬甲虫和其他害虫的繁殖材料，也可能是造成粪便大肠菌群污染的原因之一［12］。研究发现，伪粗野粉蝇（Pollenia pediculata）最早属于P.rudis类群［13］；1987年Rognes［14-15］发现了一个新种Pollenia pseudorudis，现在被认为是 Pollenia pediculata Macquart 1834的异名，是同一个种类，最初使用的大多数标本都是Pollenia pediculata。

资料显示［15-16］，伪粗野粉蝇（Pollenia pediculata）在美国是很常见的种类，是常见的群集物种之一。在北美洲伪粗野粉蝇和粗野粉蝇是很常见的蝇种，据报道伪粗野粉蝇在南非

也有发现；每年4月和6月伪粗野粉蝇数量往往达到高峰［17］，也有报道该属蝇种类越冬一代在4月中旬死亡，其后代在5月底和6月出现，其数量在7月中旬前保持较低水平，然后持续到秋季。