黑曲霉J6解钾条件优化

摘要 ［目的］探索黑曲霉J6对钾矿粉的最佳解钾条件。［方法］以查氏培养基为基础，测定黑曲霉J6对钾矿粉的解钾量，通过单因素试验和正交试验对黑曲霉J6的解钾发酵条件进行了优化。［结果］黑曲霉J6解钾最佳培养基为2%可溶性淀粉、0.5%豆粕、0.003% FeSO4、0.008% ZnSO4；其解钾的最佳培养条件为培养基初始pH 8.5、培养温度32 ℃、培养时间28 d、接种量2.5%。［结论］该研究为有效利用微生物转化低品位矿物钾技术和生物钾肥的生产提供了参考。

关键词 黑曲霉；含钾矿物；解钾条件；优化；解钾量

中图分类号 S182  文献标识码 A   文章编号 0517-6611（2024）15-0001-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.15.001

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of Potassium Dissolving Conditions of Aspergillus niger J6

YUE Dan-dan，WANG Xue-yan，YANG Wen-ling et al

（Hennan Academy of Science Institute of Biology Co.，Ltd.，Zhengzhou，Henan 450008）

Abstract ［Objective］To explore the optimal potassium dissolving conditions of Aspergillus niger J6 on potassium mineral powder.［Method］Based on Cha’s culture medium， the potassium dissolving capacity of A. niger J6 on potassium mineral powder was determined. The single-factor test and orthogonal design test were used to optimize the potassium dissolving fermentation conditions of A. niger J6. ［Result］The optimum potassium-dissolving medium for A. niger J6 was 2% soluble starch， 0.5% soybean meal， 0.003% FeSO4 and 0.008% ZnSO4.The optimal culture conditions for its potassium dissolution were an initial pH of 8.5， a culture temperature 32 ℃， a culture time of 28 days， and an inoculation amount of 25%.［Conclusion］ This study provides a reference for the effective utilization of microbial transformation technology for low-grade mineral potassium and the production of biological potassium fertilizer.

Key words Aspergillus niger;Potassium-containing minerals;Potassium dissolving condition;Optimization;Potassium dissolving capacity

土壤中钾是促进作物生长和代谢的重要营养元素之一，是植物的重要组成成分。在植物生长发育过程中，钾能增强作物的光合作用，提高光合产物的运输能力，并参与了60种以上酶系统的活化以及碳水化合物的代谢和蛋白质的合成等过程，钾还能增强作物抗逆能力和植物吸水保水能力，从而能提高作物的产量和品质。从植物营养角度可将钾分为速效钾、缓效钾和矿物钾，其中只有速效钾是植物可吸收的钾。一般土壤速效钾含量为0.05%～0.15%，土壤中 90%～98%的钾是以钾矿石的形式存在于云母和长石等含钾矿物的晶体结构中，只有经过漫长的风化过程，从晶格结构中释放出来才能被作物吸收和利用［1］。我国富氮少磷缺钾，钾资源最少。目前，我国的肥料施用量已居世界第一，钾肥进口量居世界第二。可溶性钾矿资源仅占世界总量的2%左右，虽然可溶性钾资源储量很少，但是我国却储藏有含量丰富的低品位含钾矿。有资料显示，我国约70%的耕地缺钾，约45%耕地严重缺钾［2］。钾肥供需矛盾日趋突出，因此，开发利用我国储量巨大的低品位钾矿资源意义重大。

利用微生物转化矿物钾是一项无污染、低成本、应用前景广阔的技术，可有效缓解我国钾肥紧缺的现状。但微生物转化矿物钾的过程和影响因素多而复杂，对微生物转化矿物钾的作用机理研究则是改进生物转化工艺和提高转化效率的重要依据［3-4］。Yuan等［5］用4株真菌降解黑云母和蛭石，发现这4株真菌都能使金云母和蛭石中的钾素释放出来。潘牧［6］研究了一株嗜热真菌对含钾矿物的降解作用，结果表明在液体培养条件下，该菌株能有效降解矿物，释放出活性钾素。真菌对矿物风化释放钾能力较强，这可能是由于真菌是土壤微生物群落和堆肥发酵中最普遍也是最重要的微生物，真菌在生物转化含钾岩石方面的作用也越来越受到重视。

黑曲霉（Aspergillus niger）是一种广泛存在于自然界的腐生真菌，是重要的工业发酵微生物，在生产工业酶、有机酸和次级代谢产物等方面应用广泛，如生产淀粉酶、酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸等，而且目前它被证明是一种良好的浸矿菌种，对钾长石和磷灰石等有很强的风化效果［7-17］。胡婕等［13］研究指出在菌丝体与矿物间相互作用的界面上，可能发生很多能量与物质交换的化学反应，并提出真菌对矿物的风化作用机理包括菌丝体对矿物的吸附、包裹、吸收，菌体与矿物形成有机－矿物聚集体，菌丝体对矿物的蚀刻作用及其代谢产物对矿物的化学降解作用。该研究通过对黑曲霉J6解钾培养基和培养条件的优化得出黑曲霉J6的最佳解钾条件，从而为有效利用微生物转化低品位矿物钾技术和生物钾肥的生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源。黑曲霉J6是河南省微生物工程重点实验室分离鉴定保藏的一株解钾菌株。

1.1.2 培养基。

改良查氏培养基：（NH4）2SO4  0.300 g、Na2HPO4·12H2O  0.200 g、MgSO4  0.050 g、FeSO4·7H2O 0001 g、蔗糖3.000 g，超纯水100 mL，pH 7.0。

PDA培养基：取去皮的马铃薯200.0 g，切成小块加水1 000 mL，煮沸30 min滤去马铃薯块将滤液补足至1 000 mL，加葡萄糖20.0 g，121 ℃，25 min灭菌。

1.1.3 试剂。

试验所用的碳源、氮源、无机盐及其他试剂均为国产分析纯。

钾矿石粉：试验采用钾长石成分分析标准物质，K2O、Al2O3和SiO2含量分别为 9.60%、18.63%和 6626%；粒度小于200目。

1.1.4 仪器与设备。

303A-1型恒温培养箱，上海荣丰科学仪器有限公司；SX-700高压蒸汽灭菌锅，日本TOMY；原子吸收分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；KQ-500DE台式数控超声波清洗器，东莞科桥超声波设备有限公司；MP511酸度计，上海三信仪表厂。

1.2 试验方法

1.2.1 种子液的制备。

将保存好的J6菌株转接在PDA平板上，30 ℃培养箱中培养2 d，待黑色孢子铺满整个平板即可用来制备孢子悬液。吸取5 mL PDA液体培养基冲洗黑色孢子，用细胞计数板确定孢子浓度在107。准确吸取2 mL孢子悬液接入100 mL PDA液体培养基中，30 ℃、180 r/min摇床培养24 h，作为种子液。

1.2.2 标准曲线的绘制。

准确称取在110 ℃烘2 h的氯化钾0.190 7 g，溶于超纯水中并定容至1 000 mL，此溶液为含钾100 μg/mL的钾标准溶液。

准确吸取100 μg/mL的钾标准溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL于100 mL容量瓶中，用超纯水定容，摇匀，即得0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μg/mL钾标准系列溶液。用原子吸收火焰分光光度计进行测定，以钾浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并计算线性回归方程。

1.2.3 培养基优化。

1.2.3.1

不同碳源的优化。用葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、甘露醇、麦芽糖分别代替基础培养基中的碳源，加入量为3%，基础培养基中其他成分不变，加入1 g钾矿石粉，装液量100 mL/250 mL，接种量1%（V∶V），30 ℃、180 r/min振荡培养15 d。每个处理设 3个重复，测定菌液上清钾含量，用1 mol/L乙酸铵超声波振荡30 min置换菌体中钾，计算总解钾量，所得数据应用SPSS 19.0进行单因素方差分析，得出最佳碳源。

1.2.3.2

不同氮源的优化。用蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化铵、硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵、尿素、牛肉膏、豆粕分别代替培养基中的氮源，加入量为0.3%，基础培养基中其他成分不变，加入1 g钾矿石粉，装液量100 mL/250 mL，接种量1%（V∶V），30 ℃、180 r/min振荡培养15 d。每个处理设 3个重复，测定菌液上清钾含量，用1 mol/L乙酸铵超声波振荡30 min置换菌体中钾，计算总解钾量，所得数据应用SPSS 19.0进行单因素方差分析，得出最佳氮源。

1.2.3.3

无机盐及无机盐组合的优化。根据黑曲霉菌株的生长与发酵特性，选取Fe2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+ 5种离子及其组合的硫酸盐作为筛选因素，共设计12组无机盐处理（Fe2+、Mg2+、Fe2++Mg2+、Fe2++Cu2+、Fe2++Zn2+、Fe2++Mn2+、Mg2++Cu2+、Mg2++Zn2+、Mg2++Mn2+、Fe2++Mg2++Cu2+、Fe2++Mg2++Zn2+、Fe2++Mg2++Mn2+）。在碳源、氮源优化的基础上，各处理组分别添加总量为0.001%的上述12种处理的硫酸盐（2种或3种无机盐组合按质量平均分配），基础培养基中其他成分不变，加入1 g钾矿石粉，装液量100 mL/250 mL，接种量为1%，30 ℃、180 r/min摇床培养15 d，每个处理设3个重复，测定菌液上清钾含量，用1 mol/L乙酸铵超声波振荡30 min置换菌体中钾，计算总解钾量，所得数据应用SPSS 17.0进行单因素方差分析，得出最佳无机盐或组合。

1.2.3.4

培养基正交试验优化。筛选得到的培养基最佳碳源、最佳氮源、最佳无机盐按L9（34）设计正交试验，基础培养基中其他成分不变，加入1 g钾矿石粉，装液量100 mL/250 mL，接种量1%（V∶V），30 ℃、180 r/min振荡培养15 d。每个处理设3个重复，测定总解钾量，比较不同组合的总解钾量，确定最佳培养基配方。

1.2.4 培养条件优化。

以优化的碳源、氮源及无机盐配制培养基，进行最适培养温度、培养时间、初始pH、接种量优化。培养温度设置为25、30、35、40、45 ℃，培养时间设置为0、5、10、15、20、25、30、35 d，初始pH选取5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，接种量选取0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%。

培养条件正交试验中选用培养时间、培养温度、初始pH、接种量4个因素设计4因素3水平正交试验，采用L9（34）对菌株摇瓶发酵培养条件进行优化。