1株新型鹅星状病毒的全基因序列分析
作者： 赵瑞宏 胡晓苗 侯宏艳 周学利 潘孝成 戴银
摘要 为研究新型鹅星状病毒（Novel goose astroviruses，N-GAstV）的遗传进化特征，获得了鹅星状病毒安徽分离株AstV/AHHX的全长基因，为7 251 nt。测序分析显示：AstV/AHHX具有典型的新型鹅星状病毒基因组特征。AstV/AHHX与分离株GDZJ37以及山东分离株G538和G576的遗传距离较近；同时与毒株GDZJ37、G538和G576的ORF2氨基酸序列同源性达100%，ORF1a和ORF1b的同源性也有99.6%以上，推测它们由同一毒株演化而来。ORF2氨基酸序列位点分析显示有12高变异位点，分别是第36（Y/S/H）、60（V/I）、224（T/A）、228（A/S/T）、229（P/Q）、289（T/A）、376（T/A）、456（D/E）、540（Q/L）、608（S/T）、610（E/D/G）、614（N/A/T）位氨基酸。其中第224、228、229、608、614位的氨基酸突变可能导致病毒蛋白质的构象及功能发生变化，进而改变病毒的致病能力。
关键词 新型鹅星状病毒；全基因；序列分析；组织分布
中图分类号 S 852.65 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）16-0087-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.16.018
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Whole Gene Sequence Analysis of a Novel Goose Astrovirus
ZHAO Rui-hong1，2，HU Xiao-miao1，2，HOU Hong-yan1，2 et al
（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Anhui Academy of Agricultural Science/Livestock and Poultry Epidemic Diseases Research Center of Anhui Province，Hefei，Anhui 230031；2.Anhui Province Key Laboratory of Livestock and Poultry Product Safety Engineering，Hefei，Anhui 230031）
Abstract In order to study the genetic and evolutionary characteristics of a novel goose astrovirus（N-GAstV），the full-length genes of Anhui strain AstV/AHHX were cloned in this study，and it was 7 251 nt.Sequencing analysis showed that AstV/AHHX had typical characteristics of N-GAstV.The phylogenetic tree showed that AstV/AHHX was relatively close to GDZJ37 isolates from China，G538 and G576 isolates from Shandong Province in recent years.The homology of ORF2 with GDZJ37，G538 and G576 was 100%，and the homology of ORF1a and ORF1b was more than 99.6%.Presumably they evolved from the same strain.Amino acid sequence analysis of ORF2 revealed 12 highly variable sites.They were the amino acid sites，36（Y/S/H），60（V/I），224（T/A），228（A/S/T），229（P/Q），289（T/A），376（T/A），456（D/E），540（Q/L），608（S/T），610（E/D/G），614（N/A/T）.Amino acid mutations at position 224，228，229，608 and 614 may lead to changes in the conformation and function of viral proteins，then the pathogenic ability of the virus was altered.
Key words Novel goose astroviruses；Whole gene；Sequence analysis;Tissue distribution
基金项目 安徽省科技重大专项（ 202003a06020012）；安徽省家禽产业技术体系项目（AHCYJSTX-06） 。
作者简介 赵瑞宏（1973—），男，安徽巢湖人，副研究员，硕士，从事畜禽传染学研究。
*通信作者，副研究员，博士，从事兽医微生物与免疫学研究。
收稿日期 2023-09-06
鹅星状病毒（goose astroviruses，GAstV）是星状病毒科禽星状病毒属成员，无囊膜，单股正链RNA病毒。相关研究发现，我国流行的鹅星状病毒分为2个基因型群组，以AHDY和FLX为代表毒株的GAstV-I基因型和以SD01、AHAU5毒株为代表的GAstV-II基因型［1-3］。其中，GAstV-II基因型，又称新型鹅星状病毒（novel goose astroviruses，N-GAstV），主要引发以内脏尿酸盐沉积为症状的鹅痛风病［4］。该病主要发生在3～20日龄的雏鹅，不同品种的雏鹅均可发生，发病率在80%～90%，死亡率高达50%以上［5］。病程可持续7～10 d，幸存的鹅生长缓慢，易发生继发性细菌感染。
新型鹅星状病毒基因组长约7 100 bp，包含3个连续开放性阅读框ORF1a、ORF1b和ORF2，两端含5′端非编码区和3′端非编码区以及含有3′端poly（A）结构［6-7］。其中ORF1a和ORF1b编码病毒的非结构蛋白，ORF2则编码病毒衣壳蛋白（Cap蛋白），Cap蛋白是星状病毒的主要结构蛋白，可诱导机体产生中和抗体，产生免疫应答反应［8-10］。
近年我国许多养鹅地区暴发新型鹅星状病毒病，给鹅养殖业造成了巨大的经济损失［11-15］。目前预防该病尚无有效的疫苗，研究新型鹅星状病毒的遗传进化特征，有助于进一步研究其致病机制，为更好地防控该病提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 毒株。N-GAstV安徽分离株AstV/AHHX由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所实验室分离、鉴定并保存，毒株分离于安徽省马鞍山地区。
1.1.2
主要工具酶和试剂。Taq酶、dNTP、cDNA第一链合成试剂盒等购自宝生物工程（大连）有限公司，DNA Marker、琼脂糖（电泳纯）等购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计。根据GenBanK已经发表的N-GAstV基因序列，采用Primer 5.0 设计1对 RT-PCR 特异性扩增引物，P-1：5′-TCATTACGAGCAGGAGAA-3′，P-2：5′-CTGCACCGCAACTTTAAA-3′，预期扩增片段为460 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.2.2 RNA提取。使用Trizol试剂抽提取病毒液的总RNA。以提取的总RNA为模板合成cDNA，具体方法参照TaKaRa公司cDNA第一链合成试剂盒使用说明书。
1.2.3 PCR鉴定。采用设计的引物，以获得的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系：10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 3.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA 2.5 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，加双蒸水补足60 μL。按以下程序进行扩增：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，送上海生工测序鉴定。
1.2.4 全基因测序和分析。将鉴定后的病毒cDNA样品送至上海凌恩生物科技有限公司，采用NGS二代测序方法进行全基因测序。首先采用Clustal X 1.83软件分析比对基因序列，再应用DNAstar中的Megalign程序进行同源性分析，MEGA 5.0软件Neighbor-joining方法构建遗传进化树。基因片段拼接后获得基因全长核苷酸序列，与GenBank中登录的GAstV毒株相应序列进行对比分析。参考毒株基因组GenBank登录号及信息见表1。
2 结果与分析
2.1 基因序列特征
由序列分析可知，AstV/AHHX基因全长7 251 nt，包含2个非编码区（5′UTR和3′UTR）和3个开放阅读框（ORF1a、ORF1b和ORF2），GenBank登录号为ON971223 。ORF1a、ORF1b和ORF2长度分别为3 255、1 551和2 115 nt，分别编码1 084、516和704个氨基酸。将AstV/AHHX与GenBank登录的24个水禽源的GAstV毒株相应序列进行对比分析，显示存在2种核苷酸序列差异显著的基因型。AstV/AHHX与GAstV-I基因型AHDY栋和FLX株的核苷酸序列具有明显区别，与其余N-GAstV毒株具有相似的序列特征。
2.2 全基因序列进化分析
采用MEGA分析软件，将AstV/AHHX与其他N-GAstV基因序列构建系统发育树（图1）。结果表明，AstV/AHHX与2022年国内分离株GDZJ37，以及2021年山东分离株G538和G576，聚集为同一组，尤其是毒株GDZJ37的遗传距离较近。此外，与鸭源分离株SDXT和AstV/SDTA的遗传距离较远，与2018年的安徽分离株AHAU5、AHAU3遗传距离也相对较远。
2.3 氨基酸同源性分析
对2种基因型GAstV开放阅读框编码的氨基酸序列进行同源性比较。结果表明，不同N-GAstV毒株的ORF1a、ORF1b、ORF2同源性分别为93.4%～100%、98.3%～100%、96.8%～100.90%。进一步分析可知，安徽分离株AstV/AHHX与其他N-GAstV的ORF1a、ORF1b、ORF2同源性分别为94.0%～100%、99.0%～100%、97.60%～100.90%，其中ORF1a和ORF1b同源性最高的分别是分离株AHAU3、AAstV/Goose/CHN/2021/ZY02，ORF2同源性最高的毒株G538、G576、GDZJ37。AstV/AHHX与鸭源N-GAstV毒株SDXT、AstV/SDTA的ORF1a同源性稍低，分别为94.0%、94.6%；但ORF1b、ORF2同源性平均值高达99.50%、98.45%。与2个GAstV-I毒株ORF1a、ORF1b、ORF2的同源性较低，平均分别为46.0%、60.6%、38.6%（表2）。
2.4 ORF2氨基酸序列变异位点分析
对N-GAstV的ORF2氨基酸序列位点分析，显示共有12氨基酸变异位点（同一位点大于两个毒株发生变异），分别是第36（Y/S/H）、60（V/I）、224（T/A）、228（A/S/T）、229（P/Q）、289（T/A）、376（T/A）、456（D/E）、540（Q/L）、608（S/T）、610（E/D/G）、614（N/A/T）位氨基酸（表3），其中，第36、228、610、614位氨基酸变异程度较高，存在3种不同的氨基酸类型。