加州鲈p65基因克隆及表达分析

摘要 从加州鲈（Micropterus salmoides）脑组织中克隆获得NF-κB家族中p65基因的编码区序列，该基因cDNA全长1 944 bp，ORF为1 899 bp，可编码632个氨基酸。理论分子质量为69.61 ku，理论等电点（PI）为5.66，通过生信学分析工具对p65基因蛋白结构进行分析，同时对其蛋白功能进行预测，结果显示：该基因不含有信号肽序列，同时不存在跨膜结构域，但存在1个NF-κB家族保守的结构域。多序列比对结果显示，加州鲈（Micropterus salmoides）p65与小口黑鲈（Micropter us dolomieu）的相似度最高，达99.30%；构建系统进化树发现，加州鲈（Micropterus salmoides）p65与小口黑鲈（Micropter us dolomieu）聚为一支。通过qRT-PCR结果表明，加州鲈p65基因在所取组织均有表达，在脑组织中表达量最高，其次是头肾、胸腺和心脏，在脾脏组织中的表达量最低。

关键词 加州鲈；p65；生物信息学；组织表达分析

中图分类号 S 917.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）16-0091-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.16.019

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Cloning and Expression Analysis of p65 Gene in Micropterus salmoides

QIU Jin-zhu， TANG Huai-qing， SONG Hai-xia et al

（Zhongshan Agricultural Product Quality and Safety Inspection Institute， Zhongshan， Guangdong 528400）

Abstract Cloning and obtaining the coding region sequence of the p65 gene in the NF-κ B family from the brain tissue of Micropterus salmoides， with a total cDNA length of 1 944 bp， the ORF is 1 899 bp and can encode 632 amino acids. The theoretical molecular weight is 69.61 ku， and the theoretical isoelectric point （PI） is 5.66. The protein structure of the p65 gene was analyzed using bioinformatics analysis tools， and its protein function was predicted.The results showed that the gene does not contain a signal peptide sequence and does not have a transmembrane domain， but there is a conserved domain in the NF-κ B family. The results of multiple sequence alignment show that the similarity between Micropterus salmoides p65 and Micropterus dolomieu is the highest， at 99.30%; constructing a phylogenetic tree， it was discovered that the Micropterus salmoides p65 and Micropterus dolomieu clustered together.The results of qRT PCR indicate that the Micropterus salmoides p65 gene is expressed in all selected tissues， with the highest expression level in brain tissue， followed by the head kidney， thymus， and heart， and the lowest expression level in spleen tissue.

Key words Micropterus salmoides;p65;Bioinformatics;Organizational expression analysis

基金项目 中山市2021年第二批社会公益与基础研究项目“加州鲈虹彩病毒病发病规律与防控技术研究”（2021B2056）。

作者简介 丘金珠（1989—），女，广东梅州人，工程师，硕士，从事水产经济动物病害防治研究。

*通信作者，高级工程师，从事水产经济动物病害防治研究。

收稿日期 2023-09-22

细胞核转录因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）是免疫应答与炎症反应中一种重要的调控蛋白，最初被发现能够与免疫球蛋白κ基因上的增强子特定序列（GGGACTTTCC，κB序列）结合，进而调控B细胞内κB轻链的表达^［1］。NF-κB家族由5个成员蛋白单体（p50、p52、p65 ［RelA］、Rel B和c-Rel）组成，均由N末端DNA结合域，即Rel同源结构域（Rel homology domain，RHD）形成15种具有不同功能的同源或异源二聚体^［2-3］。有研究表明，NF-κB信号通路有2种途径，其中经典途径是由病原体激活炎症分子引发，而非经典途径是由细胞发育激活^［4］。通过NF-κB经典途径活化的产物多以p50和p65的异源二聚体出现^［5］。

以往研究发现，p65基因是NF-κB的一个亚单位，经翻译修饰后可以严格调控NF-κB的转录激活，在炎症反应或经由炎症反应引发的相关疾病发生期间起到调控作用^［6］。p65可以调节TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、iNOS、IFN-β和β-防御素等免疫相关基因的表达，作为经典NF-κB家族的成员，p65也被认为是病毒感染诱导的I型和III型IFN和促炎细胞因子转录的关键调节因子^［7］。在Ouyang等^［2］研究表明，p65除了促炎免疫应答之外，还在抗病毒和IFN应答中起作用。还有研究表明，使p65的R30去甲基化后的精氨酸甲基转移酶PRMT5在调节内皮细胞炎症、增殖和分化中也起到关键作用^［8］。还有研究发现，在淡水和海洋生物中存在NF-κB途径，其中圆尾鲎具有原始的NF-κB信号通路，该通路在调节关键免疫防御分子的表达中起着重要作用^［9］；鳜鱼的NF-κB信号通路可能参与鳜鱼抗病毒感染的免疫应答^［10］。

加州鲈（Micropterus salmoides）原产于美国，中文学名大口黑鲈，自20世纪80年代引入我国后，因其生长迅速，抗病力强，适温性广，肉质鲜美，经济价值较高^［11］等特点，逐渐成为我国主要养殖品种之一。但由于养殖规模和密度的增加以及养殖环境的恶化，加州鲈养殖病害频发，病原种类复杂多样，涵盖鳗弧菌、鰤鱼诺卡氏菌、嗜水气单胞菌等细菌类，虹彩病毒、弹状病毒和双RNA病毒等病毒类，以及主要由纤毛虫引起的寄生虫类疾病^［12］，一旦处理不及时，将会给加州鲈产业造成巨大影响。p65基因在不同物种上发挥的主要功能仍需探索，目前已在部分鱼类中研究了p65基因，但p65基因在鱼类免疫中的定位尚不明确。笔者克隆加州鲈p65基因开放阅读框（ORF），对其基因序列进行生物信息学分析，分析其基因结构，预测其蛋白功能，检测该基因在各组织的分布，以期为后续深入研究加州鲈p65基因提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从中山某养殖场采集的健康加州鲈［（200±10） g/尾］。所用常规试剂均从深圳市科普生物有限公司购买；RNA提取及cDNA反转试剂盒，DNA凝胶回收纯化试剂盒和qPCR相关试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 加州鲈Total RNA的提取和cDNA的合成。

捞取暂养的健康加州鲈3尾，收集心脏、鳃、眼和肝脏等10 个器官的组织各10 ～ 20 mg，迅速放入装有Trizol的无RNA酶管中，用已消毒DEPC水处理过的钢柱打碎组织，然后置于-80 ℃保存。待样品处理完毕后，取出冷冻保存的组织样品，参照TransZol Up Plus RNA Kit 说明书提取加州鲈总RNA，再参照北京全式金EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书进行反转录合成cDNA。

1.2.2 加州鲈p65基因全长的克隆。

根据NCBI上已知加州鲈基因组信息，设计克隆p65基因ORF序列的引物p65-F和p65-R（表1），随后将PCR产物送至广州生工测序。

1.2.3 加州鲈p65基因的生物信息学分析。

用生物学软件对加州鲈p65测序结果进行序列拼接，并将拼接结果进行比对。随后利用生物信息学网站在线分析加州鲈p65氨基酸理化性质分析、涉及的通路、信号肽、跨膜结构域、亚细胞定位，并构建三维结构。在NCBI上下载与加州鲈p65氨基酸相似其他物种p65序列，利用生信分析软件对这些氨基酸序列进行进化分析。

1.2.4 加州鲈p65基因的组织表达分析。

根据p65基因序列，利用Primer 5.0 软件设计荧光定量引物pMs-p65-F和qMs-p65-R（表1），使用德国耶拿qTower3.0荧光定量仪进行qRT-PCR反应，分析p65基因在健康加州鲈各组织的特异性分布，qRT-PCR 反应体系和反应条件参考文献［1］研究方法。qRT-PCR以β-actin基因为内参基因（表1），每个样品重复检测3次，试验结果采用2^-ΔΔCt法计算，用GraphPad Prism 8 软件进行数据分析及图表处理。

2 结果与分析

2.1 加州鲈p65基因的克隆

用p65-F、p65-R作为引物，加州鲈脑组织cDNA作为模板进行PCR扩增，获得的产物测序后经NCBI Blast分析判定该扩增产物为加州鲈p65基因。ORF为1 899 bp，可编码632个氨基酸（图1）。

2.2 加州鲈p65的生物信息学分析

加州鲈p65基因编码蛋白的理论分子质量为69.61 ku，理论等电点（PI）为5.66，脂肪指数（aliphatic index）为64.53，不稳定指数为45.54，总体平均亲水性（GRAVY）为-0.616，属于亲水性蛋白（图2）。

该蛋白主要存在于细胞膜表面，为胞外蛋白；不存在跨膜区（图3），这与TMHMM Server 2.0 预测结果一致。该基因经Signal P 4.1 Server预测发现，其不存在信号肽序列（图4），为胞外蛋白。

蛋白质亚细胞定位预测p65蛋白在细胞中各位置的分布概率：73.9%（细胞核）、17.4%（线粒体）、8.7%（细胞质），Cell-PLoc对p65进行亚细胞定位预测的结果为细胞核。SoftBerry-Psite预测该序列功能位点，发现该序列N-糖基化位点9个和蛋白激酶C磷酸化位点8个，N-豆蔻酰化位点和C末端定位信号序列微体各6个，酪蛋白激酶II磷酸化位点5个，cAMP 和 cGMP相关磷酸化位点2个，CAAX box 2个，糖胺聚糖附着位点和NF-kb背侧结构域信号各1个。