杂交3倍体泥鳅鳍细胞系染色体组构成研究

摘要  通过天然4倍体（4n=100）和2倍体（2n=50）泥鳅杂交创制不同子代杂交组合（4n♀×2n♂、2n♀×4n♂）。以传代20次的杂交3倍体泥鳅鳍细胞系为材料，采用常规冷滴片法制备染色体标本，通过吉姆萨染色确定数目及核型；通过银染法及CMA3/DA/DAPI三重荧光染色技术对其进行带型分析。结果显示：正反交3倍体鳍细胞系的染色体分裂相数目为3n=75，核型公式15m + 6sm + 54t，NF=96；正反交3倍体泥鳅鳍细胞系的染色体分裂相中显示有3个银染点，均位于第1组中部着丝粒染色体（M1）短臂的端部区域；正反交3倍体泥鳅鳍细胞的染色体中期分裂相中显示有3个CMA3荧光信号点，均位于M1区域。研究表明：杂交3倍体泥鳅鳍细胞经细胞培养传代20次后的染色体组成未发生改变，其染色体数目、核型和带型与3倍体泥鳅其他体细胞结果一致。

关键词  杂交3倍体泥鳅;鳍细胞系;核型分析;银染;CMA3/DA/DAPI

中图分类号  S966.4  文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2024）18-0067-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.18.015

   开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on Chromosome Composition of Hybrid Triploid Loach （Misgurnus anguillicaudatus） Fin Cell Line

GUO Wen-xuan，ZHOU Zi-yu，MA Ke-xin et al

（College of Aquatic and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian，Liaoning 116023）

Abstract  In this study，a natural tetraploid loach （4n=100） was crossed with a diploid loach （2n=50） thus creating the different offspring hybrid combinations （4n♀×2n♂，2n♀×4n♂）.Chromosome samples of hybrid triploid loach fin cell passed for 20 times were prepared via conventional cold drop method.The chromosome number and karyotype were determined via Giemsa staining; Banding analysis were conducted via Ag-NORs and CMA3/DA/DAPI staining.The results showed that the metaphase chromosome number of the fin cells of the hybrid triploid loach was 3n=75，and the karyotype formula was 15m+6sm+54t，NF=96;three silver staining signal points were observed in the chromosome metaphase of hybrid triploid loach fin cells，located at the end region of the first pair of central centromeric chromosomes （M1）;there were three CMA3 signal points in the chromosome metaphase of hybrid triploid loach fin cells，which were located at the region of chromosomes （M1）.The study showed that the chromosome composition of hybrid triploid loach fin cells remained unchanged after 20 times of cell culture passage，and the chromosome number，karyotype and band type were consistent with other somatic chromosomes of triploid loach.The results laid the foundation for the cytogenetics of hybrid triploid loach and provided a theoretical basis for cytogenetics of triploid loaches.

Key words  Hybrid triploid loach;Fin cell line;Karyotype analysis;Ag-NORs;CMA3/DA/DAPI

基金项目  国家自然科学基金项目（31272650）。

作者简介  郭文轩（1999—），女，辽宁葫芦岛人，硕士研究生，研究方向：水产遗传育种与繁殖。*通信作者，副教授，博士，硕士生导师，从事水产动物繁殖育种研究。

收稿日期  2023-10-24

泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）隶属于鲤形目（Cypriniformes）鳅科（Cobitidae）泥鳅属（Misgurnus），是我国水产养殖行业的潜力产品［1］。据报道，泥鳅存在自然多倍化现象，在我国的天然水域中已发现5种不同倍性的泥鳅种类，包括2倍体（2n=50）、3倍体（3n=75）、4倍体（4n=100）、5倍体（5n=125）和6倍体（6n=150）［2-4］。多倍体泥鳅普遍具有个体大、生长快及适应性强等优良的经济性状，具有很大的育种潜力［5］。通过化学或物理等诱导方法培育3倍体存在价格较贵，成功率较低等问题，而4倍体与2倍体泥鳅杂交的方式可以稳定高效地获得3倍体［6-8］。Li等［9-10］研究发现，天然4倍体泥鳅是遗传4倍体，可产生正常的卵子（2n）和精子（2n），并通过天然2倍体和4倍体泥鳅成功创制杂交3倍体子代。

鱼类细胞培养作为重要的试验技术，为遗传学、病毒学和生理学等研究提供了试验基础。据报道，该技术始于20世纪60年代［11］，随后众多鱼类组织细胞系相继成功建立。其组织种类多样，如肾脏、鳍、鳔、性腺和肝脏等［12］。鳍细胞相较于其他类型体细胞的优势在于鳍是可再生器官，既能保护试验材料，又可以重复利用，更有利于物种细胞遗传学的相关研究。近年来，有研究已将传代培养的鳍细胞作为材料成功应用在2倍体和4倍体泥鳅的染色体研究中［13-14］。为探究正反交3倍体泥鳅鳍细胞经细胞培养传代后的染色体组构成，笔者以不同3倍体杂交组合（4n♀×2n♂，2n♀×4n♂）为研究对象，通过鳍细胞体外培养法获得正反交后代鳍组织传代20代细胞后，分别采用传统吉姆萨染色法、银染法和CMA3/DA/DAPI三重荧光染色法对其进行核型及带型分析，旨在为泥鳅的细胞遗传学研究提供数据支撑。

1  材料与方法

1.1  材料

亲本4倍体泥鳅采自湖北省武汉市，2倍体泥鳅采自辽宁省大连市。选取发育良好的亲本进行人工催产及杂交，获得4n♀×2n♂，2n♀×4n♂ 2种杂交组合，孵育温度（25±1） ℃，暂养于大连海洋大学养殖楼水族箱中。正反交后代各选取5尾，体长及体重见表1。

1.2  鳍细胞培养及染色体标本制备

2种杂交组合（4n♀×2n♂，2n♀×4n♂）各选取5尾泥鳅的部分鳍组织进行培养，原代及传代培养方法均参照张博等［12］的方法进行。采用常规染色体标本制备方法［15］，将得到的20代鳍细胞放入秋水仙素溶液（0.1 mg/mL）25 ℃下恒温培养3 h，用C6H5Na3O7溶液（0.8%）低渗40 min，卡诺固定液（CH3OH∶CH3COOH=3∶1，现用现配）固定15 min，重复3次后放入-20 ℃冰箱中。冷滴片法制备染色体标本后，用10% Giemsa染液作用45 min，蒸馏水冲洗后自然风干，置于普通光学显微镜（Leica DM 2 000）下镜检拍照。

1.3  染色体数目统计及核型

4倍体与2倍体泥鳅正反交后代均选取50个分散均匀的中期分裂相（10个分裂相/每尾鱼）进行数目统计。根据Levan等［16］方法，对分散均匀的分裂相进行核型分析，得出核型公式。

1.4  银染

参照Howell快速银染法［17］，并根据实际情况稍作改进。向65 ℃恒温箱预热2 h的玻片上按照体积比2∶1滴加50% AgNO3溶液与2%明胶溶液，盖上盖玻片，65 ℃黑暗条件下处理1～2 min，每隔30 s观察染色程度，当染成茶褐色时取出，自来水冲洗后自然风干。置于普通光学显微镜（Leica DM 2 000）下镜检拍照。

1.5  CMA3/DA/DAPI三重荧光染色

根据Schweizer等［18-19］方法，并根据实际情况略微改进。将染色体标本置于65 ℃恒温箱预热2 h后滴加0.5 mg/mL CMA3，黑暗条件下作用60 min；依次放入0.1 mg/mL DA和DAPI染缸染色15 min。MI缓冲液洗缸中漂洗。洗耳球吹干，滴加封片剂（丙三醇∶缓冲液=1∶1），4 ℃冰箱保存，置于荧光显微镜（Leica DM 2 000）下镜检拍照。

2  结果与分析

2.1  染色体数目及核型分析

从4倍体与2倍体泥鳅正反交后代4n♀×2n♂，2n♀×4n♂传代20次的鳍细胞中期分裂相中选取形态清晰且分散良好的50个中期分裂相进行统计分析。结果显示：正反交每尾个体的10个分裂相众数均为75条，个体间不存在差异；4n♀×2n♂后代的染色体数目为70 ～ 79条，众数为75条，占比70%；2n♀×4n♂后代的染色体数目为72 ～ 79条，众数为75条，占比66%（表2）。正反交后代鳍组织培养20代的细胞染色体数目均为3n=75（图1a、图1c），核型公式为3n=15m+6sm+54t，NF = 96（图1b、图1d）。

2.2  Ag-NORs分析

4倍体与2倍体泥鳅正反交后代（4n♀×2n♂，2n♀×4n♂）传代20次的鳍细胞中期分裂相均显示3个Ag-NORs（图2a、图2c）；根据核型分析可知，正反交后代染色体的NORs均位于第1组中部着丝粒染色体（M1）短臂的末端位置（图2b、图2d）。

2.3  CMA3/DA/DAPI分析

4倍体与3倍体泥鳅正反交后代（4n♀×2n♂，2n♀×4n♂）传代20次的鳍细胞染色体标本经CMA3/DA/DAPI三重荧光染色处理后，选择分散良好的中期分裂相镜下观察。结果显示：用蓝光（λ=360～400 nm）激发，在正反交后代的中期分裂相中可观察到3条DA/DAPI荧光带（图3a、图3d）；用蓝光（λ=440～480 nm）激发，正反交后代的中期分裂相中均表现出3个CMA3阳性部位（图3b、图3e）；由核型分析可知，CMA3阳性位点位于第1组中部着丝粒染色体（M1）短臂的末端部位（见图3c、图3f）。