山豆根ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

摘要  以山豆根为试验材料，采用正交试验考察DNA、引物、Mg2+、dNTPs、Taq酶5个因素对ISSR-PCR反应体系的影响，建立并优化山豆根ISSR-PCR反应体系条件。结果表明：山豆根ISSR-PCR反应体系（20 μL）最优条件为Mg2+浓度3 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq酶1 U，引物0.5 μmol/L，模板DNA 100 ng，运用该体系从100条UBC引物中筛选到10条清晰、多态性好的引物。采用正交试验设计可有效建立山豆根ISSR-PCR反应的最优体系，为山豆根的亲缘关系，种质资源遗传多样性评价及品种鉴定和系统分类等研究提供科学依据。

关键词  山豆根；ISSR-PCR体系优化；正交试验；引物筛选

中图分类号  S567  文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2024）18-0078-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.18.017

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of ISSR-PCR Reaction System and Primer Selection of Sophora tonkinensis Gagnep

LI Jin-mei1，GUAN Miao-juan1，HUANG Ding1，2 et al

（1.College of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning， Guangxi 530200; 2.Key Laboratory of Resources Protection and Utilization of Traditional Chinese Medicine and Ethnic Medicine， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning， Guangxi 530200）

Abstract  Taking Sophora tonkinensis as materaial， orthogonal experiments were used to investigate the effects of DNA， primers， Mg2+， dNTPs， and Taq enzymes on the ISSR-PCR reaction system， and the conditions of ISSR-PCR reaction system of Sophora tonkinensis were established and optimized. The results showed that the optimal conditions for the ISSR-PCR reaction system （20 μL） of Sophora tonkinensis including 3 mmol/L Mg2+， 0.2 mmol/L dNTPs， 1 U Taq enzyme， 0.5 μmol/L primer， 100 ng template DNA. Ten primers with good polymorphism were selected from 100 UBC primers by this system. The optimal system of ISSR-PCR reaction can be effectively established by orthogonal experiment design， which provides a scientific basis for the research of genetic relationship， genetic diversity evaluation of germplasm resources， variety identification and systematic classification of Sophora tonkinensis.

Key words  Sophora tonkinensis Gagnep;ISSR-PCR system optimization;Orthogonal test design;Primer screening

基金项目  广西中医药大学中药学一流学科项目（2019XK093）；广西中医药大学青年创新研究团队项目（2018QT001）。

作者简介  李金梅（1998—），女，广西灵山人，硕士研究生，研究方向：中药资源学。*通信作者，教授，博士，从事中药资源保护与开发研究。

收稿日期  2023-10-07

山豆根（Sophora tonkinensis Gagnep）为豆科越南槐属植物，常以干燥根和根茎入药，主要分布在我国广西、贵州、云南等地［1］。其化学成分主要为生物碱、黄酮和三萜类化合物等［2］，具有抗癌、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗心律失常等药理作用［3-6］。

分子标记技术ISSR （inter-simple sequence repeat）又称简单重复序列间扩增，由1994年加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等［7］提出。ISSR因其具有无需预先基因组序列信息、快速、稳定、多态性丰富、重复性强及成本低等优点［8］，广泛应用于植物种质资源收集和鉴定、遗传多样性和亲缘关系、优异基因的发掘和定位等方面。目前国内外对药用植物山豆根的分子鉴定研究多采用DNA条形码技术，而有关ISSR分子技术研究较少。笔者以山豆根为试验材料，采用正交试验结合ISSR的方法，优化Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物和模板DNA等影响因素，建立山豆根最佳反应体系，旨在为植物山豆根亲缘关系、种质资源、遗传多样性等研究提供参考依据。

1  材料与方法

1.1  试验材料

试验材料为山豆根的新鲜幼嫩叶，采自广西中医药大学仙葫药圃，样品由广西中医药大学李良波研究员鉴定为山豆根。摘取山豆根新鲜幼嫩叶，用蒸馏水冲洗叶片，75%乙醇擦拭表面，晾干至-20  ℃冰箱保存备用。

1.2  试验方法

1.2.1  改良CTAB法提取基因组DNA。

采用改良CTAB法提取山豆根嫩叶组织DNA，取2 μL基因组总DNA溶液与1 μL loading Buffer 混合，点样于0.7%琼脂糖凝胶上样孔，在1×TAE缓冲液中电压120 V电泳40 min。电泳结束采用Gel Red 染料凝胶泡染，凝胶成像，观察记录并分析其基因组完整性，取1 μL基因组总DNA溶液，使用微量紫外分光光度计检测其浓度和纯度，并置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2  ISSR-PCR反应体系的正交试验设计。

以山豆根基因组DNA为模板，采用UBC835引物为固定引物，以L16（45）开展正交试验（表1、表2），对4水平5因素（模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs、Taq 酶）配比进行体系优化。选用该引物TM梯度条带多态性、完整性较好的最佳温度，根据反应程序至PCR仪进行扩增，反应体系总体积为20 μL，其中含2 μL 10×Buffer，其余不足由灭菌水补足。每处理重复3次。

1.2.3  ISSR-PCR扩增。

建立ISSR-PCR反应体系体积为20 μL，其中Taq酶1 U，模板50 ng，引物0.3 μmol/L，Mg2+ 2 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，10×Buffer 2 μL，其余由灭菌水补足。反应程序为94 ℃ 预变性5 min，94 ℃ 变性 30 s，50 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，循环30次，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。

取扩增产物3 μL，与1 μL loading Buffer 混合，点样于1.5%琼脂糖凝胶上样孔中，在1×TAE缓冲液中电压120 V 电泳40 min，结束后使用Gel Red 染料泡染，凝胶成像系统成像，观察记录并分析各组条带。

1.2.4  正交试验数据统计与处理。

参照何正文等［9］方法，以条带清晰、多态性好为指标，对各组条带进行打分，多态性好且清晰记16分，反之则记1分。3次重复试验评分数值采用SPSS 19软件进行直观分析、方差分析、多重比较。

2  结果与分析

2.1  山豆根总基因组DNA

豆科植物山豆根总基因组DNA电泳、紫外检测结果见表3、图1，结果表明，该植物DNA的条

带清晰明亮，有少量RNA污染；DNA的OD260/280的数值均在1.8～2.0，OD260/230的比值在1.9～2.1。

2.2  正交试验结果

由于模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs、Taq酶5个影响因素各水平的配比不同，扩增结果存在差异（图2）。根据电泳结果对每组条带评分，评分结果见表4。根据评分结果进行直观分析、方差分析和多重比较。

2.2.1  正交试验直观分析。

正交试验3次重复处理的平均值能够反映各因素对反应体系的影响情况，根据3种药用植物各重复处理评分结果进行直观分析，结果见表5。①极差R大小表明各因素对反应体系的影响程度，山豆根各因素对反应体系的影响因素从大到小表现为Mg2+>模板DNA> dNTPs >Taq酶>引物；②同一因素均值最大所对应的水平为该因素最佳水平，山豆根的最佳水平为Mg2+水平4、dNTPs水平2、Taq酶水平2、引物水平4、模板DNA水平4。

2.2.2  正交试验方差分析。

为了进一步判断各因素对山豆根ISSR-PCR体系的影响程度，对正交试验评分结果进行方差分析。比较各因素F值，F值越大、表示该因素影响程度越大。

由表6可知，在山豆根ISSR-PCR反应体系的影响程度表现为Mg2+>模板DNA>Taq酶>dNTPs>引物，其中Mg2+和模板DNA具有显著性（P<0.05），P值分别为0.010、0.038。

根据方差分析F值比较各因素对山豆根ISSR-PCR反应体系的影响程度，发现其结果与直观分析结果不一致，但其最大的影响因素一致。正交试验中的极差分析法仅具有方便直观的特点，未经过统计学检验，而方差分析经过统计学检验更加准确。

2.2.3  正交试验Duncan多重比较。

为进一步确定山豆根ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳水平，根据正交试验结果对各因素进行Duncan多重比较分析，对同一因素4个水平的均值进行比较，判断4个水平的差异显著性。根据山豆根Duncan多重比较结果（表7）得知，Mg2+水平4均值最高，与水平1有显著差异，因此选择水平4为最佳水平，即3.0 mmol/L。dNTPs 水平2均值最高，与水平1、水平3差异不显著，与水平4差异显著，而水平4与水平1、水平3差异不显著，因此选择水平2为最佳水平，即0.2 mmol/L。在Taq 酶和引物因素中，4个水平无显著差异，综合考虑选择均值最高的Taq酶水平2和引物水平4为最佳水平，分别为1.0 U和0.5 μmol/L。模板DNA因素中，水平4均值最高，与水平1、水平3有显著差异，与水平2无显著差异，因此选择水平4为最佳水平，即100 ng。

综上所述，根据方差分析和多重比较分析，确定山豆根的ISSR-PCR反应体系的最优条件：Mg2+ 3.0 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq酶1.0 U，引物0.5 μmol/L，模板DNA 100 ng。