肉串制品中猪牛羊源性成分多重荧光PCR检测方法研究

摘要  ［目的］建立畜类肉串产品中常见的黄牛、绵羊和猪源性成分的多重荧光PCR检测方法，实现肉串制品中动物源性成分的快速鉴别。［方法］比较磁珠法和柱膜法对肉糜组织中DNA的提取效果，优化实时荧光PCR多重检测方法，比较58、60 ℃ 2个退火温度下黄牛、绵羊、猪源性成分扩增效果。［结果］试验采用的2种DNA提取方法效果相似，DNA溶液的A260/A280值均能满足PCR检测要求;58 ℃为最优退火温度，此时黄牛、绵羊、猪源性成分均能有效扩增，且最低检出的DNA浓度均为10-3 ng/μL。方法中用到的引物和探针特异性较好，均未产生非特异性扩增。［结论］试验建立的黄牛、绵羊和猪源性成分的多重PCR检测方法能为肉制品中动物源性成分的快速定性分析提供方法参考。

关键词  黄牛;绵羊;猪;源性成分;实时荧光多重PCR

中图分类号  TS251.7  文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2024）18-0184-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.18.039

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on Detection Method for Pig，Cow and Sheep Derived Components by Multiple Fluorescence PCR in Meat Skewer Products

YAO Yan-ling，ZHOU Yu-dong，WANG Wen-yu et al

（Jiaxing Testing Institute for Food，Drug and Product Quality Control，Jiaxing，Zhejiang 314050）

Abstract  ［Objective］To establish a multiple fluorescence PCR detection method for common cattle，sheep and pig derived components in animal meat skewer products，and to achieve rapid identification of animal derived components in meat skewer products.［Method］Compared the extraction effect of DNA from meat mince tissue using magnetic bead method and column membrane method，optimized the real-time fluorescence PCR multiple detection method，and compared the amplification effect of cattle，sheep，and pig derived components at two annealing temperatures of 58 and 60 ℃.［Result］The two DNA extraction methods used in the experiment had similar effects，and the A260/A280 values of the DNA solution could meet the requirements of PCR detection.58 ℃ was the optimal annealing temperature，at which point the cattle，sheep and pig derived DNA could be effectively amplified，and the lowest detected DNA concentration was 10-3 ng/μL.The primers and probes used in the method had good specificity and had not produced non-specific amplification.［Conclusion］The multiplex PCR detection method established by the application scope experiment for cattle，sheep and pig origin can provide a method reference for rapid qualitative analysis of animal origin components in meat products.

Key words  Cattle;Sheep;Pig;Derived component;Real-time fluorescence multiplex PCR

基金项目  浙江省市场监督管理局雏鹰计划培育项目（CY2023322）。

作者简介  姚艳玲（1980—），女，浙江嘉兴人，高级工程师，硕士，从事食品微生物及分子生物检测研究。

收稿日期  2023-10-28

烧烤食品近年来备受年轻人喜爱，尤其以猪、牛、羊等畜肉类肉串最为常见，因其含有多种维生素、氨基酸，且烧烤口味鲜美，深受年轻人青睐，也丰富了人们的餐桌文化。随着市场上猪肉、牛肉和羊肉价格差距的拉大，某些商贩在肉制品加工过程中掺假售假，通过牛羊油浸泡，或者牛羊类香精香料及调味料添加等方式处理后，冒充牛、羊肉进行销售，损害了消费者利益，也给食品安全带来了风险。目前，食品中动物源性成分的鉴定主要是通过形态学、细胞学、生物化学、酶联免疫吸附法（ELISA）、红外光谱技术等［1-3］，随着聚合酶链式反应（PCR）技术的快速发展，动物源性的鉴别检验也有了相关研究。在动物源性定量检测方面，有研究者通过PCR技术、定量PCR技术或者数字PCR技术对肉制品和其他食品中的猪、牛、羊、兔等动物源性成分进行定量检测分析［4-12］;在定性检测方面，采用探针法PCR技术、SYBR实时荧光PCR技术、PCR可视化检测技术等对肉制品的动物源性成分进行多重检测研究［13-21］。

上述研究在肉源性鉴别方面有了较大的进展，但由于大多研究立足于生鲜肉制品，而针对市场上常见的经过调味料腌制的肉串制品的掺假研究较少，且部分调味料对DNA模版提取及PCR检测过程中存在一定的干扰，影响检测结果的准确性。因此，笔者以猪、牛、羊源性肉串制品为研究对象，建立多重实时荧光PCR快速检测方法，为日常肉串产品的快速筛查提供方法参考，满足肉制品监管需求。

1  材料与方法

1.1  试验材料

1.1.1  主要试剂。

DNA Extraction Kit Ver.5.0［宝生物工程（大连）有限公司］，Prepito DNA Tissue 10 Kit［铂金埃尔默医学诊断产品（上海）有限公司］。实时荧光PCR试剂为Premix Ex TaqTM PCR预混试剂［宝生物工程（大连）有限公司］。试验用水为一级纯化水。

1.1.2  引物探针。

该研究采用的黄牛、绵羊和猪的引物、探针见表1，参考国家标准GB/T 38164—2019，根据仪器检测通道，设计探针，引物和探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3  仪器设备。

Roche LightCycler 480Ⅱ实时荧光定量PCR，罗氏诊断产品（上海）有限公司;全自动核酸提取仪，铂金埃尔默医学诊断产品（上海）有限公司;Nanodrop one超微量分光光度计，赛默飞世尔科技（中国）有限公司;MK 10干式恒温器，杭州奥盛仪器有限公司;Legend Micro 21R离心机，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2  试验方法

1.2.1  DNA模板提取。由于该试验针对的样品为经过腌制的肉串制品，因此从市场上采购了经调味料腌制的黄牛肉串。该肉串样品处理分为2组，一组样品在DNA提取前，先用70%乙醇进行浸泡，然后用纯化水进行多次漂洗，除去大部分调味料，还原肉组织的原色，再进行DNA提取;另一组不做任何处理，直接提取DNA。同时把已知黄牛肌肉组织作为对照组，比较3组样品的DNA提取效果。

该试验比较了磁珠法和柱膜法对动物组织DNA的提取效果。磁珠法采用的是全自动核酸提取仪进行DNA提取，分别称取上述3组样品各10 mg，加入裂解液和蛋白酶K后，经56 ℃裂解，直到组织完全溶解，把裂解液加入深孔板中，用全自动核酸提取仪进行DNA提取。柱膜法则使用商品化的试剂盒进行手工提取，分别称取上述3组样品各20 mg于1.5 mL离心管中，加裂解液、蛋白酶K和RNase A，经56 ℃温育3 h后，吸上清液于新的1.5 mL离心管中，加200 μL缓冲液和200 μL无水乙醇，充分混匀，然后将液体全部加入吸附小柱内，将吸附小柱装入配套收集管中，按试剂盒说明书进行DNA提取。用超微量核酸测定仪检测DNA溶液的浓度和纯度。

1.2.2  多重荧光PCR检测方法的建立。

根据试验设计，把3种动物源性的上、下游引物（10 μmol/L）分别按等体积混合，制成上、下游混合引物，同时把3种动物源性的探针（10 μmol/L）也按等体积混合，制成混合探针。反应体系配制：Premix Ex TaqTM PCR预混试剂10.0 μL，上、下游混合引物各0.4 μL，混合探针0.8 μL，模板DNA为2.0 μL，反应体系共20 μL，剩余体积用无菌去离子水补足。PCR反应扩增条件：95 ℃预变性30 s;95 ℃变性 5 s，退火温度58 ℃，延伸1 min，共40个循环。

1.2.3  灵敏度试验。

取黄牛、绵羊和猪3种肌肉组织中提取的DNA溶液，

以10倍系列稀释的方法，用纯化水分别稀释至10、100、10-1、10-2、10-3、10-4 ng/μL，用制成的DNA溶液进行灵敏度试验。

1.2.4  特异性试验。

选取黄牛、牦牛、山羊、绵羊和猪5种常见畜类动物的肉糜，按质量等比例混合后，提取混合DNA模板，配制反应体系、设置PCR反应条件，对3种目标动物源性成分的引物和探针进行特异性试验。

2  结果与分析

2.1  DNA提取结果

按照“1.2.1”方法提取DNA，比较2种方法对肌肉组织中DNA的提取效果，每种方法做6个平行试验，计算样品中DNA浓度、A260/A280的平均值，结果见表2。由表2可知，2种方法提取的DNA效果较为接近。但是未经预处理的肉制品组织中提取DNA溶液的A260/A280值不能满足PCR检测需要，说明肉串中的各种调味料对DNA提取或检测存在一定干扰。因此，经调味料腌制过的样本在提取DNA之前需经过预处理，其提取效果才能满足PCR检测需求。该试验后续检测用DNA模板均采用柱膜法提取。

2.2  多重荧光PCR检测分析

为了能同时对黄牛、绵羊和猪3种动物源性成分进行多重检测，在设计探针时选取FAM、CY5和VIC这3个通道，并优化检测方法。根据“1.2.2”配制反应体系，把3对引物和3个探针等比例混合，配制成混合引物和混合探针，并比较了58、60 ℃ 2种常用退火温度下的扩增效果。结果显示，在退火温度60 ℃时，黄牛和猪源性成分均能有效扩增，但绵羊源性成分扩增效果不佳；在退火温度为58 ℃时，3种目标物源性成分均能有效扩增。绵羊源性成分在2种退火温度下的扩增结果图1。因此，在混合体系下，退火温度设置为58 ℃，黄牛、绵羊和猪3种动物源性成分均能有效扩增。

2.3  灵敏度试验

试验将黄牛、绵羊和猪的DNA溶液均稀释至10  ng/μL，然后按照10倍稀释梯度进行稀释，制成100、10-1、10-2、10-3、10-4 ng/μL的DNA混合梯度稀释液，在混合体系下，退火温度设置为58 ℃进行试验，每个浓度扩增时做3个平行试验，扩增结果见图2。