激素及pH对大蒜愈伤组织诱导研究

摘要 探讨大蒜愈伤组织诱导及增殖分化的影响因素，建立大蒜愈伤组织诱导、增殖及器官分化的培养体系。结果表明，适合大蒜愈伤组织诱导及增殖的培养基激素浓度及pH为2 mg/L NAA，2 mg/L 6-BA，1 mg/L 2，4-D和pH 5.8；苍山蒜愈伤组织出芽分化的最佳培养基激素浓度及pH为1 mg/L NAA，3 mg/L 6-BA，pH 5.8；苏联蒜愈伤组织出芽分化的最佳培养基激素浓度及pH为2 mg/L NAA，2 mg/L 6-BA，pH 6.1；苍山蒜和苏联蒜愈伤组织生根分化的最佳培养基激素浓度及pH均为1 mg/L NAA，pH 5.8，表明高浓度的2，4-D有利于大蒜愈伤组织的诱导，但并不利于其分化。

关键词 大蒜；组织培养；愈伤组织；激素；pH

中图分类号 S633.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）19-0041-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.19.009

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on the Induction of Garlic Callus by Hormones and pH

YU Da-sheng¹， MA Lin²， ZHENG Ze-rong¹ et al

（1.Laiwu Vocational and Technical College， Jinan，Shandong 271100;2.Shandong Agricultural University，  Taian， Shandong 271018）

Abstract The factors that affected callus induction， multiplication and organ differentiation of garlic were explored and the high efficient regeneration system was established. The hormone concentration and pH value of the culture medium suitable for garlic callus induction and proliferation were selected： 2 mg/L NAA，2 mg/L 6-BA，1 mg/L 2，4-D and the pH of the medium was 5.8. The hormone concentration and pH value of the culture medium suitable for garlic callus organ differentiation were selected. The optimal medium hormone concentration and pH value for callus differentiation of Cangshan garlic were 1 mg/L NAA，3 mg/L 6-BA and the pH of the medium was 5.8. The optimal medium concentration and pH value for callus differentiation of Soviet garlic were 2 mg/L NAA，2 mg/L 6-BA and the pH of the medium was 6.1. The optimal medium concentration and pH value for callus rooting and differentiation of two varieties are 1 mg/L NAA and pH 5.8. Research has also shown that high concentrations of 2，4-D were beneficial for the induction of garlic callus， but not for its differentiation.

Key words Garlic;Tissue culture;Callus tissue;Hormone;pH

基金项目 山东省农业良种产业化重点项目“多倍体大蒜新品种培育”；国家公益性行业（农业）科研专项（200903018）。

作者简介 于大胜（1974—），男，辽宁法库人，副教授，硕士，从事植物育种、植物保护研究。*通信作者，教授，从事蔬菜生物学研究。

收稿日期 2023-10-17

大蒜引入我国驯化栽培已有2 000多年的历史，具有较高的营养价值和经济价值，尤其是大蒜素（蒜氨酸）经蒜氨酸酶作用形成的挥发性硫化物，使大蒜具有杀菌、抗癌、抗衰老等作用和独特的大蒜风味。大蒜适应能力较强，在我国各地都有栽培，包括山东莱芜、金乡、苍山，江苏射阳、太仓，安徽亳州、来安等。我国是世界上最大的大蒜生产国和消费国，也是出口创汇大国，总栽培面积30万hm²，干蒜头总产量500余万t，约占全世界总产量的2/3。

大蒜植株再生有2条主要途径，即愈伤组织途径和不定芽途径，外植体的取材部位不同，诱导产生愈伤组织的能力也不相同，产生的愈伤组织在质地、形态、颜色、细胞组成及分化能力上也有明显差异。用于大蒜组织培养的外植体范围较广，叶片^［1-2］、鳞茎^［3］、茎盘^［4］、茎尖^［5］、根尖^［6］、总苞及花药^［7-9］等器官都已获得了大蒜再生植株。

植物细胞进行脱分化产生愈伤组织及愈伤组织去分化形成器官，都必须依赖植物激素，它们能够诱导外植体细胞重新进入分裂状态。研究表明，同一种激素对不同植物产生的效果不同，因此，培养基必须根据不同的植物添加适宜种类和浓度的植物激素^{［4，10-14］}，才能获得最佳的培养效果。笔者在前人工作的基础上，采用不同来源的愈伤组织，探讨激素种类及pH对建立大蒜植株再生体系的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试大蒜品种为“苍山蒜”“苏联蒜”“二水早”及“金蒜3号”。试验在莱芜职业技术学院和山东农业大学开放实验室中进行。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体选取。

叶片获取：生长健壮大蒜植株，经洗涤、冲洗、乙醇和升汞消毒处理后，于无菌操作台剔除叶脉，切取0.5 cm² 的叶片接种于培养基。

鳞茎获取：自然休眠的大蒜，选取无病无霉变无伤疤的蒜瓣，去除外层保护叶，切除蒜瓣基部褐色蒜踵，流水冲洗30～50 min后，用体积比70％的乙醇消毒30 s，然后用 0.1％的升汞消毒15 min，无菌水冲洗5～6次。切取蒜瓣中部厚度为0.3～0.4 cm，先划十字后再切割成 0.5 cm² 的外植体于无菌操作台接种。

茎尖获取：蒜瓣剥去外面鳞叶，经洗涤、冲洗、乙醇和升汞消毒处理后于无菌操作台切取0.5 cm的茎尖末端接种于培养基。

根尖获取：无霉无伤疤大蒜鳞茎严格消毒后，接种于由琼脂制成的培养基，待根长至1 cm左右时，无菌条件下切取根尖接种于培养基。

1.2.2 培养条件。

基本培养基为MS培养基、1/2MS培养基及B₅培养基，各培养基均附加30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂，所有培养基均调节pH 5.8～6.2，121 ℃高压灭菌20 min。按既定方案，各培养基均添加不同浓度和比例的植物激素NAA、6-BA及2，4-D，用于筛选适合大蒜愈伤组织的诱导培养基、增殖培养基、出芽培养基和生根培养基。各处理均在温度（25±1）℃培养，光照强度为2 000 lx，光照时间为16 h/d。

1.2.3 大蒜愈伤组织诱导、增殖、出芽和生根培养基的筛选。

选取的植物生长激素分别为NAA、6-BA和2，4-D，pH设定为5.5、5.8和6.1，采用正交设计L₉（3⁴）方案。

2 结果与分析

2.1 外植体类型对大蒜愈伤组织诱导的影响

以苍山蒜的叶片、鳞茎、茎尖和根尖为外植体诱导愈伤组织，30 d后统计诱导率，结果见表1。由表1可知，培养基及培养条件相同时，各外植体的出愈时间及诱导率差异较大。其中鳞茎的出愈时间最短，平均出愈时间为 11 d，且诱导率最高。茎尖的诱导率因其细胞分裂活动旺盛也较高，4种外植体材料中叶片与根尖的诱导率则较低。经方差分析可知，4种外植体的诱导率均差异极显著，因此外植体类型对大蒜诱导率影响效果显著。

尽管鳞茎和茎尖的诱导率都较高，且出愈时间短，愈伤组织含水量也低，但茎尖的剥离及消毒较为复杂，而大蒜鳞茎的取材方便，因此认为大蒜鳞茎是愈伤组织诱导的最佳外植体。

2.2 培养基类型对大蒜愈伤组织诱导的影响

选取MS、1/2MS、B₅ 3种培养基，通过分析其成分对大蒜愈伤组织诱导的影响，寻求大蒜愈伤组织诱导的最佳培养基，培养时间为30 d，每种培养基中均添2 mg/L NAA、2 mg/L 6-BA和1 mg/L 2，4-D，pH设定为5.8。

由表2可知，MS培养基出愈时间最短，为12 d，且诱导率最高，达74.45%，与B₅和1/2MS培养基差异极显著，这说明培养基成分对大蒜鳞茎愈伤组织诱导影响较大。B₅培养基虽诱导率较高，但出愈时间较晚，因此选定MS培养基为后续试验的培养基类型。

2.3 激素种类及pH对大蒜愈伤组织诱导的影响

选取苍山蒜和苏联蒜鳞茎为试验材料，MS为基本培养基，按试验设计分别添加不同浓度的NAA、6-BA和2，4-D，调节pH为5.5、5.8和6.1，采用L₉（3⁴）正交试验设计9个处理，培养时间为25 d，结果见表3。

由表3可知，在不添加任何植物激素情况下，愈伤组织诱导率都极低；对2个大蒜品种正交极差分析表明各因素对2个大蒜品种鳞茎愈伤组织诱导率的影响作用相同，均为pH＞6-BA＞2，4-D＞NAA。在添加植物激素的处理中，以MS+2 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA+1 mg/L 2，4-D这一组合愈伤组织诱导率最高，且各激素配比及pH对2个品种大蒜的影响结果一致。相同条件下，虽然苍山蒜的诱导率普遍高于苏联蒜，但差异不显著。这说明大蒜愈伤组织的诱导需要植物激素的参与。由此认为，苍山蒜和苏联蒜的最佳培养基激素配比及pH为2 mg/L NAA，2 mg/L 6-BA，1 mg/L 2，4-D和pH为5.8。

2.4 激素种类及pH对大蒜愈伤组织增殖的影响

将试验诱导出的愈伤组织在不同植物激素配比及不同pH的MS培养基上进行继代培养，培养30 d后统计愈伤组织的生长状况，以生长量及增殖倍数表示，通过正交试验进行极差分析，结果见表4。由表4可知，虽然苍山蒜愈伤组织的增殖横向比较总体优于苏联蒜，但差异不大；纵向比较结果显示，2，4-D不仅不促进愈伤组织的增殖，反而明显抑制愈伤组织的增殖，说明2，4-D虽然有利于愈伤组织的诱导，但不利于愈伤组织的增殖。与NAA相比，6-BA对愈伤组织继代增殖的效果更好。与大蒜愈伤组织诱导获得的结果不同，2个品种大蒜愈伤组织增殖的最佳培养基配方稍有差异，出现这种现象的原因可能与种属特性有关，需进一步探讨。