黑漆实蝇线粒体基因组基因结构分析

摘要 为探究黑漆实蝇线粒体基因组基因结构，基于测定的黑漆实蝇的线粒体全基因组，采用DNAMAN V6 软件测算线粒体全基因组13个蛋白编码基因（PCGs），22个trnA基因AT skew =（A-T）/（A+T）、GC skew=（G-C）/（G+C）的值，分析黑漆实蝇核苷酸的偏移率；使用Win32 CodonW软件分析蛋白质基因密码子的使用个数以及同义相对密码子RSCU值的使用频率；利用MITOS WebServer和tRNAscan-SE 2.0软件对trnA的二级结构进行分析，为物种诊断、系统发育和进化生物学提供依据。

关键词 黑漆实蝇；线粒体全基因组；相对密码子使用频率；trnA基因二级结构

中图分类号 S433 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）19-0077-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.19.017

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Mitochondrial Gene Structure Analysis of Bactrocera （Zeugodacus） scutellaris

HUANG Zhen¹，GUO Qiong-xia²

（1.Changle Airport Customs of Fuzhou，Fuzhou，Fujian 350209;2.Fuzhou Customs Technology Center，Fuzhou，Fujian 350001）

Abstract In order to explore the mitochondrial genome gene structure of Bactrocera（Zeugodacus）scutellaris，based on the measured mitochondrial whole genome of B.（Z.）scutellaris，the values of ATskew =（A-T）/（A+T）and GC skew =（G-C）/（G + C）of 13 protein-coding genes（PCGs）and 22 trnA genes in the whole mitochondrial genome were measured by DNAMAN V6 software.Win32 CodonW software was used to analyze the number of protein gene codons and the frequency of synonymous relative codon RSCU values.MITOS WebServer and trnAscan-SE 2.0 software were used to analyze the secondary structure of trnA，providing evidence for species diagnosis，phylogeny and evolutionary biology.

Key words Bactrocera （Zeugodacus） scutellaris;Mitochondrial whole genome;Relative codon usage frequency;Secondary structure of trnA gene

基金项目 福建省自然科学基金项目（2011J01066，2012JO1061）;福州海关科研项目（FK2022-09）。

作者简介 黄振（1985—），男，福建莆田人，高级农艺师，从事植物检疫研究。*通信作者，研究员，从事植物检疫研究。

收稿日期 2023-10-25

黑漆实蝇［Bactrocera（Z.）scutellaris Bezzi］属双翅目（Diptera）实蝇科（Tephritidae）果实蝇属（Bactrocera）。果实蝇属主要分布在热带和亚热带地区，主要危害果蔬，是危险性极高并可对果蔬生产与贸易造成巨大影响的有害生物之一，在果实蝇的自然分布或流行区，寄主作物果实被害率可达 10％～80％^［1］，是世界各个国家或地区农业检疫部门重点关注和阻截的危险性害虫^［2］。近年来，果实蝇属害虫在口岸进境果蔬物品检疫中经常被截获，由于危害性大，形态相似，鉴定困难，是具有重要经济意义的危险性害虫，因此果实蝇属现已成为国际上许多国家的研究重点^［3-4］。线粒体基因组作大多数为环状闭合双链DNA，昆虫线粒体基因组的组成包含从基本的分子序列到全部的基因组结构，具有排列相对保守，基因结构简单，进化速率快，高拷贝以及物种内基因几乎不发生重组的母系遗传特点。线粒体具有自己的线粒体基因组^［5］，为完整的细胞器，基因组具有比核基因组更高的突变率，具有强大的遗传功能^［6］。随着DNA测序技术的快速发展，线粒体基因组成为研究动物起源进化及群体遗传分化的理想对象及一种重要的分子标记技术手段^［7］，被用于不同分类水平的物种鉴定、生物遗传进化、分子标记和系统发育研究，也是区别形态相似的近缘种的有用工具，目前被广泛用于物种，尤其是同属近缘种的分类鉴定、种间的分子进化和系统发育进化关系等研究^［8-9］。越来越多昆虫种类的线粒体全基因组被测序^［10］。笔者基于线粒体全基因组测序技术，对具有重要经济意义的重要种类B.（Z.）scutellaris的线粒体全基因组进行了测定与基因基本结构、核苷酸含量、蛋白质密码子的使用频率及trnA基因的二级结构进行分析^［11-13］，以期为黑漆实蝇的物种鉴定、生物遗传进化、系统发育和分子鉴定提供更有价值的信息和依据。

1 样品与方法

1.1 供试的样品

供试样品为B.（Z.）scutellaris的线粒体序列，来自云南口岸，成虫采用形态分类的方法进行鉴定，样品放置于-20 ℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 偏移率的测算。

利用已测定的黑漆实蝇全基因组序列，基于DNAMAN V6测算AT skew=（A- T）/（A+T）、GC skew=（G-C）/（G+C）的值，分析黑漆实蝇全基因组、蛋白质、trnA基因核苷酸及其J和N编码链核苷酸AT skew、GCskew的偏移。

1.2.2 蛋白质密码子的使用频率。

使用Win32 CodonW对黑漆实蝇全基因组序列的13个蛋白质基因密码子的使用个数以及同义相对密码子RSCU值的使用频率进行分析。

1.2.3 trnA的二级结构。

采用MITOS WebServer和tRNAscan-SE 2.0对黑漆实蝇全基因组序列的22个trnA基因的二级结构进行分析。

2 结果与分析

2.1 全基因组序列核苷酸的偏移率

黑漆实蝇线粒体基因组总序列为15 919 bp（GenBank登录号为：MW 892725），核苷酸A、C、G、T的含量分别为39.1%、16.2%、9.9%、34.3%，表现为A>T>C>G，线粒体基因组序列核苷酸A+T含量为73.4%，其中蛋白质编码基因PCGs、trnA基因、rRNA基因、非编码控制区A+T的含量分别为71.8%、74.4%、78.0%和78.4%，存在A、T碱基偏向性^［14］。通过对黑漆实蝇全基因组核苷酸偏移率：AT skew =（A-T）/（A+T）、GC skew=（G-C）/（G+C）测算，黑漆实蝇线粒体基因组全序列的AT skew偏斜为正值（0.065），GC skew偏斜为负值（-0.241），表明基因组序列中A碱基和C碱基的百分比含量分别高于T碱基和G碱基，这种现象与大部分昆虫的线粒体基因组 AT／GC偏斜一致^［15］；PCGs的 AT偏移率 J链为 -0.066，高于N链-0.277；GC Skew N链为0.344，高于J链 -0.195；trnA基因AT Skew J 链为 0.008，高于N链 -0.045，GC Skew N链为0.306，高于J链-0.008。因此，PCGs和trnA基因均存在AT向J链偏移，GC向N链偏移，与J链和N链碱基组成偏向性结果一致，这2条链之间存在核苷酸组成与AT偏斜、GC 偏斜，符合大多数昆虫线粒体基因组基本的碱基规律。核苷酸组成不对称性的现象表现了后生动物线粒体全基因组的显著特征^［16］。黑漆实蝇线粒体全基因组核苷酸组成见表1。

2.2 蛋白质编码基因

黑漆实蝇线粒体全基因组13个蛋白质编码基因序列总长11 301 bp，A+T总含量为71.8%，J编码链为6 897 bp，N编码链核苷酸为4 404 bp；13个蛋白质编码基因包含 3 754个密码子，J链含有2 290个，N链含有1 464个，使用频率最高的密码子为：第 2位点为 U和第 3位点为U或A；相对同义密码子RSCU值的使用频率大于1的有28个，其中第 3位点均为U或 A；在所有22种氨基酸的密码子中，UUA（L）的使用频率 N及相对密码子RSCU使用频率均最高，分别为368和3.68，其次为AUU（I），N、RSCU分别为278、1.66，UUU（F），N、RSCU分别为239、1.44；密码子组成前 4位的氨基酸占总量的39.00%，4种氨基酸含量分别为：亮氨酸（Leu）600个（15.98%）>异亮氨酸（Ile）335个（8.92%）>苯丙氨酸（Phe）333个（8.87%） >丝氨酸（Ser）226个（5.23%）；20种氨基酸中半胱氨酸（Cys）47个（2%），含量为最低。每种氨基酸使用频繁的密码子为NNA和NNU，反映核苷酸组成AT偏好性^［17］。黑漆实蝇线粒体基因组蛋白质编码基因密码子使用统计见表2。

2.3 trnA基因

黑漆实蝇线粒体全基因组共22个trnA基因，序列长度在63～72 bp，总长度1 471 bp，通过对黑漆实蝇线粒体全基因组trnA基因二级结构分析，trnA基因二级结构中，除精氨酸（R）和苯丙氨酸（F）缺少假尿嘧啶（T）环以及丝氨酸（S1）缺少二氢尿嘧啶（DHU）环外，其余 19个trnA基因均能折叠形成典型三叶草二级结构图。线粒体基因组 22个 trnA基因中，共存在20处碱基对错配，错配均为G-U，其中8处错配分别位于trnA、trnC、trnE、trnF、trnP、trnS1的氨基酸接受臂，2处位于trnN、trnT的假尿嘧啶臂，10处位于trnD、trnQ、trnG、trnH、trnF、trnP、trnS1、trnY的二氢尿嘧啶臂^［18-19］。黑漆实蝇线粒体22个trnA的三叶草结构见图1。

3 小结与讨论

黑漆实蝇线粒体全基因A+T含量为73.4%，PCGs 为71.8%，A、T碱基偏向性，AT偏斜为正值，GC偏斜多为负值。其中蛋白质编码基因PCGs、rRNA基因、trnA基因、非编码控制区A+T的含量分别为71.8%、74.4%、78.0%和78.4%，黑漆实蝇均存在碱基AT 含量明显高于GC，存在AT的偏向性，符合大多数线粒体基因组基本的碱基规律，这一特征与后生动物典型的线粒体基因组AT偏移相一致；通过偏移率计算，黑漆实蝇的线粒体基因组AT 为0.065，为正值，GC为-0.241，这一特征和其他实蝇线粒体基因组的序列具有相似性^［20］。