烟叶多肽的提取工艺优化及其抗氧化活性研究
作者： 陈月星 师叶琳 杜雪婷 冯利茹 高薪淞
摘要 ［目的］以烟叶为原料，进行烟叶多肽的提取及其抗氧化活性研究。［方法］采用酶法辅助水提醇沉法提取烟叶多肽，应用单因素试验考察加酶量、酶解pH、酶解时间、浸提温度、底物浓度5个单因素对烟叶多肽提取量的影响，采用响应面法确定烟叶多肽的最佳提取工艺，并分析烟叶多肽对DPPH自由基和羟基自由基的清除作用，研究烟叶多肽的抗氧化活性。［结果］以处理样品质量1 g为基准，烟叶多肽的最佳提取工艺为加酶量4 200 U、酶解pH 8.2、酶解时间2.5 h、浸提温度49 ℃、底物浓度4.2%，烟叶多肽提取量为88.23 mg/g。按照该条件所提取的烟叶多肽对DPPH自由基和羟基自由基的清除率分别为83.09%和73.84%，表明烟叶多肽具有一定的抗氧化能力。［结论］该研究为烟叶的药用价值和烟叶多肽的药物开发提供一定的理论基础和技术指导。
关键词 烟叶；多肽；酶解；提取工艺优化；响应面法；抗氧化活性
中图分类号 R284 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）19-0158-06
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.19.034
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Study on the Optimization of Extraction Process of Tobacco Polypeptide and Its Antioxidant Activity
CHEN Yue-xing1，2，SHI Ye-lin1，DU Xue-ting1 et al
（1.School of Biomedical and Food Engineering，Shangluo University，Shangluo，Shaanxi 726000;2.Shaanxi Qinling Characteristic Biological Resources Industry Technology Research Institute，Shangluo，Shaanxi 726000）
Abstract ［Objective］Taking tobacco as experiment material，extraction process of tobacco polypeptide and its antioxidant activity was studied in this research.［Method］Tobacco polypeptide was extracted by enzyme-assisted water extraction and alcohol precipitation.Single factor test was used to investigate the effects of enzyme addition，enzymolysis pH，enzymolysis time，extraction temperature and substrate concentration on the extraction rate of tobacco polypeptide.The optimal extraction process of tobacco polypeptide was determined by response surface method.The scavenging activity of tobacco polypeptide on DPPH and hydroxyl radicals was detected.［Result］The optimal extraction process for tobacco polypeptide was as follows （based on 1 g tobacco sample）：enzyme addition 4 200 U，enzymolysis pH 8.2，enzymolysis time 2.5 h，extraction temperature 49 ℃ and the substrate concentration 4.2%.Under the optimized extraction process，the extraction rate of tobacco polypeptide was 88.23 mg/g.The scavenging rates of DPPH and hydroxyl radicals of the tobacco polypeptide were 83.09% and 73.84%，respectively.Tobacco polypeptide was of a certain antioxidant capacity.［Conclusion］This study provides a certain theoretical basis and technical guidance for the medicinal value of tobacco leaves and the drug development of tobacco peptides.
Key words Tobacco;Polypeptide;Enzymolysis;Extraction process optimization;Response surface method;Antioxidant activity
基金项目 陕西省大学生创新训练计划项目（202411396005）；陕西省科技厅自然科学基础研究面上项目（2024JC-YBMS-187）。
作者简介 陈月星（1984—），女，河北衡水人，讲师，博士，从事农林生物专业相关教学与科研工作。
收稿日期 2024-03-21
烟草（Nicotiana tabacum L.）为一年生或有限多年生草本［1］。烟叶中含有多种化学成分，包括糖类物质、有机酸和脂质等［2］。烟叶的含氮化合物主要有蛋白质和生物碱等，其中蛋白质经酶分解转化为多肽，具有一定生物活性的化合物分子，稳定性较高，具有易消化吸收、促进免疫、降血脂等多种人体代谢和生理调节功能，除此以外，烟叶多肽还具有较好的抗氧化活性［3 -7］，为烟叶的深加工利用和多肽类药物研发带来更多可能性［8］，各种多肽疫苗、抗肿瘤多肽、诊断多肽等多肽类药品和保健品相继被开发［9］。烟叶中蛋白质含量较高，烟叶多肽的提取和开发为多肽研究提供了一种新型的研究资源，有利于烟叶资源的深度开发和利用。
近年来多肽合成发展迅速，主要使用生物合成法和化学合成法。生物合成法分别有天然提取法、酶解法、发酵法等［10-11］。酶法制备多肽时，酶的种类、用量和酶解条件对制备的多肽质量和纯度均具有显著的影响［12-13］。江连洲等［14］采用多种蛋白质水解酶对大豆蛋白进行酶解，发现经碱性蛋白酶水解后的大豆蛋白溶解率较酶解之前的蛋白质溶解率高，且蛋白质的理化性质也可得到一定程度的改善；王章存等［15］采用风味蛋白酶对大豆蛋白酶解，酶解后不但降低了大豆蛋白的抗原性，同时也提高了原有大豆蛋白的乳化性和起泡性，改善了大豆蛋白的加工性能。
基于此，笔者采用酶法辅助水提醇沉法提取烟叶多肽，通过单因素试验和响应面法优化烟叶多肽的提取工艺，并进一步研究所提取烟叶多肽的抗氧化活性，为烟叶的药用价值和烟叶多肽的药物开发提供一定的理论基础和技术指导。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试材。烟叶，由陕西省商洛市烟草公司提供。
1.1.2 试剂。碱性蛋白酶（河南万邦实业有限公司）；牛血清蛋白（天津佰玛科技有限公司）；石油醚（天津市科密欧化学试剂有限公司）；考马斯亮蓝G-250（国药集团化学试剂有限公司）；无水乙醇（天津市科密欧化学试剂有限公司）；氢氧化钠（天津市科密欧化学试剂有限公司）；盐酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）；抗坏血酸（国药集团化学试剂有限公司）；硫酸亚铁（天津市致远化学试剂有限公司）；水杨酸（天津市百世化工有限公司）；过氧化氢（西安天茂化工有限公司）；DPPH（合肥巴斯夫生物科技有限公司）；试验用水为超纯蒸馏水。
1.1.3 仪器。电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9240A，上海齐欣科学仪器有限公司）；高速万能粉碎机（FW-100，北京中兴伟业仪器有限公司）；标准检验筛（60目，孔径0.28 mm，浙江省上虞市道墟大亨桥化验仪器厂）；电子天平（TP-313，北京丹佛仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（XY-SYG系列，上海昕仪仪器仪表有限公司）；高速离心机（TDL-40B，上海安亭科学仪器厂）；紫外可见分光光度计（UV-721，上海佑科仪器仪表有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 原料预处理。
选取优质的烟叶，将其在40 ℃的干燥箱中干燥至恒重，粉碎后过60目网筛，所得烟叶粉加入石油醚进行脱脂处理，离心后收集滤渣，将滤渣在40 ℃条件下再次烘干获得脱脂粉。将干燥后的烟叶脱脂粉置于锥形瓶中备用。
1.2.2 标准曲线的绘制。
将牛血清蛋白质标准品精确称量10 mg，然后加水定容至100 mL，在4 ℃贮存。将考马斯亮蓝G-250精确称量100 mg，加入无水乙醇50 mL，完全溶解，加H3PO4溶液100 mL，再用水定容至1 000 mL，摇匀待用。按照表1配制相应的标准溶液，配制完成后，再分别往试管中加入考马斯亮蓝溶液5 mL，振荡摇匀，混合后静置，5 min后测量波长595 nm处的吸光度［16］，以牛血清蛋白质溶液浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.3 烟叶多肽的提取。
将预处理的烟叶粉末称取1.0 g于锥形瓶中，根据设定的不同底物浓度向其中添加适量的蒸馏水，再加入适量的碱性蛋白酶，振荡摇匀，调节pH，将锥形瓶放在设定好温度的水浴锅中进行酶解，浸提结束后在高温条件下灭酶10 min，冷却后过滤，取其上清液。上清液中加入无水乙醇，静置24 h，最后离心（4 000 r/min，30 min）取上清液备用。
1.2.4 烟叶多肽提取量的测定。
取1 mL烟叶多肽提取液，按标准曲线绘制方法显色后，在595 nm波长处测量样品溶液的吸光度。对照标准曲线回归方程求得样品溶液中的多肽浓度，进而可求得样品中多肽提取量。多肽提取量的计算公式如下：
多肽提取量（mg/g）=CV/m
式中：C为计算所得样品质量浓度（mg/mL）；V为提取液的体积（mL）；m为样品质量（g）。
1.2.5 单因素试验。
采用酶法辅助水提醇沉法提取烟叶多肽，考察加酶量、酶解pH、酶解时间、浸提温度、底物浓度5个因素对烟叶多肽提取量的影响，因素和水平见表2。