健康与患根腐病三七根际和根内微生物群落结构与多样性研究
作者： 丁子元 赵学强 李宁 陈欣怡 孙玉婷 郑晓卫 李睿尧 夏冰 杨娟
摘要 ［目的］研究三七健康植株和根腐病植株根内及根际土的微生物群落结构，探究其与三七根腐病发生的相关性。［方法］利用Illumina高通量测序技术对云南文山连作3年的健康植株根内及其根际土壤、根腐病植株根内及其根际土壤中的微生物群落结构及多样性进行分析。［结果］健康植株及其根际土壤与根腐病植株及其根际土壤中微生物群落的丰富度存在显著差异。黄腐植株根际土中的优势微生物为节杆菌属（Arthrobacter）、毛壳菌属（Chaetomium）和周刺座霉属（Volutella），绿腐植株根际土中的优势微生物为节杆菌属（Arthrobacter）和短梗蠕孢属（Trichocladium）。黄腐植株根内优势微生物为被孢霉属（Mortierella）和木霉属（Trichoderma），绿腐植株根内优势微生物为假单胞菌属（Pseudomonas）、土赤壳菌属（Ilyonectria）和小不整球壳属（Plectosphaerella）。［结论］三七根腐病的发生与植株根际及根内微生物多样性和群落结构密切相关。
关键词 三七；根腐病；根际微生物；高通量测序；群落结构；微生物多样性
中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）19-0151-07
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.19.033
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Microbial Community Structure and Diversity in Rhizosphere and Roots of Healthy and Root Rot Panax notoginseng
DING Zi-yuan1，2， ZHAO Xue-qiang3， LI Ning4 et al
（1. Nutrition & Health Research Institute， COFCO Corporation， Beijing 102209; 2. Beijing Key Laboratory of Nutrition， Health and Food Safety， Beijing 102209; 3. North China Pharmaceutical Group Aino Co.， Ltd.， Shijiazhuang，Hebei 052165; 4. New Drug Research & Development Company of NCPC， Shijiazhuang，Hebei 050000）
Abstract ［Objective］To study the microbial community structure in the root and rhizosphere soil of healthy and root rot infected plants of Panax notoginseng， and explore the correlation between microbial diversity with root rot of P. notoginseng.［Method］The microbial community composition and diversity of the roots and rhizosphere soil of healthy and root rot plants in Wenshan， Yunnan Province， which had been continuously cultivated for 3 years were analyzed by using Illumina high-throughput sequencing system.［Result］The richness of microbial communities in healthy plants roots and rhizosphere soil was significantly different from that in root rot plants roots and rhizosphere soil. The dominant microorganisms in the rhizosphere soil of yellow rot plants were Arthrobacter， Chaetomium and Volutella， and that of the rhizosphere soil of green rot plant were Arthrobacter and Trichocladium. The dominant microorganisms in roots of yellow rot plants were Mortierella and Trichoderma， while the dominant microorganisms in roots of green rot plants were Pseudomonas， Ilyoectria and Plectosphaerella.［Conclusion］The occurrence of root rot in Panax notoginseng is closely related to the diversity and community structure of microorganisms in the rhizosphere and roots of plants.
Key words Panax notoginseng;Root rot;Rhizosphere microbe;High-throughput sequencing;Community structure;Microbial diversity
基金项目 河北省重大科技成果转化专项（20282901Z）。
作者简介 丁子元（1984—），男，安徽安庆人，高级工程师，博士，从事环境微生物研究。
*通信作者，高级工程师，硕士，从事环境微生物研究。
收稿日期 2023-08-02
三七又名田七、金不换，属于五加科人参属多年生草本植物，是我国名贵的药食同源中药材，兼具营养和药用双重价值，具有良好的抗凝血、抗血栓、缓解疼痛等作用，对预防和治疗心脑血管疾病具有显著疗效［1］，被广泛应用于食品和医药领域。因为三七适宜冬暖夏凉的气候，且喜潮湿和半阴的生态环境，导致其分布范围很小，仅局限于23.5°N附近的中高海拔区域，道地产地为云南省文山市及周边地区。云南文山种植三七的历史悠久，三七种植产业得到了政府的大力支持，其三七种植产量达到全国总产量的98%以上。三七的需求量日益增长，由于其种植范围非常狭窄，促进了我国的三七种植逐渐向集约化、规模化种植发展。由于连年进行大面积的单一化种植，且三七喜阴、生长环境温暖湿润，易被圆斑病、根腐病等侵染，导致三七连作障碍问题日益严重［2］。
根腐病是对三七危害最严重的病害之一，占三七各种病害的70%以上，可以导致三七产量降低5%～70%甚至绝收，且种植土壤往往需要间隔10年以上才能再次种植［3］，该病害已严重阻碍了三七产业的扩产，造成了重大的经济损失。三七根腐病分为黄腐型、急性青枯型、干裂型、髓烂型、茎基干枯型、湿腐型等，最常见的为黄腐型和急性青枯型［4］。黄腐型表现为地上部分植株矮小，叶片逐渐变黄，根部逐渐干腐，发病持续时间为60～120 d。急性青枯型又称绿腐型，常见于2～3年生三七，发病时地上植株叶片绿色下垂，根部常有渗出的滴状脓液，一般从地上部分出现表征到死亡仅7 d左右。
三七根腐病是典型的土传性病害，长时间高密度单一化的种植使得土壤微生物多样性降低、病原菌积累，从而导致根腐病的发生［5］。相关报道表明，病原真菌、病原细菌及病原动物均能导致三七根腐病的发生。罗文富等［6］报道假单胞细菌（Pseudomonas）、茄病镰孢菌（Fusarium solani）、细链格孢菌（Alternaria tenuis）和小杆线虫（Rhabditis elegans）是导致三七根腐病的致病原。缪作清等［7］研究表明引起三七根腐病的真菌种类主要包括毁坏柱孢霉（Cylindrocarpon destructans）、茄腐皮镰孢菌（F.solani）、尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）、三七黄腐病菌（Cylindrocarpon didynum）、草茎点霉（Phoma herbarum）、恶疫霉菌（Phytophthora cactorum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）等。文增叶等［8］从三七根腐病幼苗中分离得到一株尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum），将病原菌回接后发现其有很强的致病性。张晋豪等［9］从患病三七中分离并鉴定吲哚金黄杆菌（Chryseobacterium indoloqenes）为根腐病病原细菌，为国内首次报道可引起三七根腐病。以上研究中，病原真菌的种类比较多，主要包括链格孢菌属（Alternaria）、柱孢菌属（Cylindrocarpon）、镰刀菌属（Fusarium）、疫霉菌（Phytophthora）、茎点霉属（Phoma）等，病原细菌包括假单胞菌属（Pseudomonas）和吲哚金黄杆菌。
高通量测序技术也称为深度测序或“下一代测序技术”，具有测序通量高、能定量和成本低廉等优点［10］，相较于传统的微生物培养技术，通过扩增和测序能够同时检测可培养和不可培养微生物，能够更深入挖掘样品中微生物的种类，目前被广泛应用于食品［11-12］、环境［13-14］等的微生物群落结构和多样性分析。
近年来，科研人员对三七根腐病的研究主要集中在根腐病病原菌分离［6-9］、根腐病生物防治［15-16］、根腐病与三七种植过程中的营养因子或抗菌剂等相关性方面的研究［17-18］，而针对三七根际土壤及内生微生物菌群变化及其与三七根腐病害发生的相关性研究报道较少。该研究通过Illumina高通量测序技术对根腐病植株（包括黄腐型和绿腐型）及健康植株根内生和根际土壤中微生物进行测序分析，比较不同样品的多样性与对应的优势微生物种群，并进一步探讨导致三七根腐病的病原菌种类，对通过微生态制剂进行土壤恢复和消除连作障碍具有实际指导意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试材。
三七根际土与植株样品采集自云南文山科技示范园（23°49′N、104°06′E，海拔1 631 m），样品信息如表1所示。
1.1.2 试剂。真菌DNA提取试剂盒，AU3111，无锡百泰克生物技术有限公司；磁珠组织DNA提取试剂盒，AU20011，无锡百泰克生物技术有限公司；PCR引物，生工生物工程（上海）股份有限公司。