一株南方红豆杉内生菌HDSW的抗肿瘤活性研究

摘要［目的］鉴定南方红豆杉抗肿瘤内生菌HDSW，并初步研究其抗肿瘤机制。［方法］基于16S rDNA测序鉴定菌株HDSW的种属，通过MTT试验、平板细胞集落形成试验、细胞黏附试验、划痕试验和流式细胞术检测HDSW发酵液的有机溶剂提取物对胃癌细胞MGC-803的抑制活性，利用实时定量PCR方法探索其抗肿瘤的分子机制。［结果］菌株HDSW被鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus pumilus），其发酵液的乙酸乙酯提取物作用于胃癌细胞MGC-803可有效降低其存活率，减弱其黏附能力，抑制迁移能力，诱导细胞凋亡。菌株HDSW发酵液的乙酸乙酯提取物可显著增强促细胞凋亡基因p53、Bax和Caspase 3的表达水平，抑制细胞凋亡拮抗基因Bcl-2的表达。［结论］南方红豆杉内生菌HDSW可产生具有显著抗胃癌细胞MGC-803活性的次级代谢产物，且乙酸乙酯可将其提取出来，具有潜在的开发价值。

关键词 南方红豆杉；内生菌；抗肿瘤活性；细胞增殖；细胞迁移

中图分类号 R285 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）19-0145-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.19.032

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Antitumor Activity of an Endophytic Bacteria HDSW from Taxus chinensis var.mairei Cheng et L.K.Fu

LI Ping，HU Jian-ran，GUO Chun-yan et al

（Department of Biological Science and Technology，Jinzhong University，Jinzhong，Shanxi 030619）

Abstract ［Objective］To identify the antitumor endophytic bacterium HDSW of Taxus chinensis var.mairei and preliminarily study its antitumor mechanism.［Method］The strain HDSW was identified based on 16S rDNA sequencing.The inhibitory activity of the organic solvent extract of HDSW fermentation broth on gastric cancer cell line MGC-803 was detected by MTT assay，plate cell colony formation assay，cell adhesion assay，scratch assay，and flow cytometry.The molecular mechanism was explored by real-time PCR.［Result］The strain HDSW was identified as Bacillus pumilus.The ethyl acetate extract of the fermentation broth could effectively reduce the survival rate，weaken the adhesion capability，inhibit migration capability，and induce cell apoptosis of the gastric cells MGC-803.The ethyl acetate extract from the fermentation broth of strain HDSW could significantly enhance the expression of pro-apoptotic genes p53，Bax and Caspase 3，and inhibit the expression of anti-apoptotic gene Bcl-2.［Conclusion］The endophytic Bacillus HDSW from Taxus chinensis var.mairei can produce secondary metabolites with significant anti-gastric cancer cell MGC-803 activity，which can be extracted by ethyl acetate，and possess potential development value.

Key words Taxus chinensis var.mairei Cheng et L.K.Fu;Endophytic bacteria;Antitumor;Cell proliferation;Cell migration

基金项目 山西省基础研究计划（自由探索类）青年项目（202203021222292）；山西省基础研究计划（自由探索类）面上项目（20210302123493）；山西省教育厅高等学校科技创新项目（2022L501，2021L487）；晋中学院“百亿工程”天然产物开发利用创新团队培育项目。

作者简介 李平（1983—），女，山西大同人，副教授，博士，从事微生物学及天然产物活性研究。*通信作者，副教授，博士，从事天然产物活性研究。

收稿日期 2024-05-05

南方红豆杉（Taxus chinensis var.mairei Cheng et L.K.Fu）是常绿乔木，为我国一级濒危保护植物，主要分布于我国陕西、河南、江西、广西、福建等省（区）^［1］。山西省是南方红豆杉在我国自然分布的最北界，主要位于太行山南段以及中条山东端区域，海拔750～1 000 m的湿润山坡及水流旁^［2］。研究发现，红豆杉属植物含有多种药理活性成分，如紫杉醇、槲皮素、红豆杉多糖、紫杉碱、胡萝卜甾醇等。其中，紫杉醇是经典的高效抗癌化合物，在20世纪90年代初已被美国食品药品监督管理局正式批准为新抗癌药物，但是，由于其在红豆杉属植株中的含量极低，无法满足市场需求^［3］。因此，寻找新的紫杉醇等具有重要药理活性的天然化合物资源成为当前抗肿瘤新药研发领域的重要科学任务。

植物内生菌是一类在其生活史的某个或全部时期定殖于植物的组织和器官内的微生物，宿主植物无明显的感染症状，细菌、真菌和放线菌是其主要类群^［4］。在长期进化过程中，由于植物细胞内次级代谢产物合成相关的基因发生水平转移^［5］等因素，部分内生菌具备了产生与宿主植物相同或相似的化合物的能力。Li等^［6］从南方红豆杉根部分离了一株内生真菌IRB54，能够产生10-DABⅢ（10-脱乙酰基浆果赤霉素Ⅲ），可作为半合成生产紫杉醇的替代资源；陈淑娟等^［7］从南方红豆杉内生青霉菌Penicillum sp.H⑥.1 发酵产物中分离出了震颤毒素Penitrem A，可抑制黑色素瘤细胞A375；张盼盼等^［8］分离得到了111株南方红豆杉内生和根际放线菌，以肿瘤细胞株SGC-7901和NCI-H460为检测对象，在抑制率超过40%的内生放线菌中，内生菌占44.4%。因此，南方红豆杉内生真菌和内生放线菌是抗肿瘤天然产物的潜在资源库，但是，目前鲜见在内生细菌中发现具有抗肿瘤活性的菌株。该研究以产自山西省东南部的南方红豆杉植株为材料，获得了一株能够产生抗肿瘤有效物质的内生细菌，并对其活性进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试材与试剂。

南方红豆杉植株样本采自山西省晋城市陵川县南方红豆杉种植基地。胃癌细胞系MGC-803购买于武汉博士德生物工程有限公司。细胞培养基RPMI Medium 1640、胎牛血清（FBS）和TRIzol试剂购买于赛默飞世尔科技公司。二甲基亚砜（DMSO）、噻唑蓝（MTT）和丝裂霉素C（Mitomycin C）购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。溴化十六烷基三甲铵（CTAB）购买于北京索莱宝科技有限公司。细胞凋亡检测试剂盒购买于江苏凯基生物技术股份有限公司。SYBR Premix Ex Taq^TM GC和逆转录试剂盒购买于宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.1.2 仪器与设备。

旋转蒸发仪RE-5ZAA（上海亚荣生化仪器厂）；高压蒸汽灭菌锅（日本TOMY SEIKO公司）；倒置显微镜CKX41-C31BF（奥林巴斯株式会社）；细胞计数仪Cellometer Auto1000［耐细隆生物仪器（上海）有限公司］；CO₂细胞培养箱（赛默飞世尔科技公司）；iMark酶标仪［伯乐生命医学产品（上海）有限公司］；高速冷冻离心机（日本日立公司）；流式细胞仪［碧迪医疗器械（上海）有限公司］；StepOne Plus 型实时定量PCR仪（赛默飞世尔科技公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 南方红豆杉内生细菌的分离。

取新鲜的南方红豆杉植株的枝条，用自来水冲洗干净，再在超净工作台中用无菌蒸馏水洗涤3次，在75%乙醇溶液中浸泡杀菌1 min，用无菌蒸馏水清洗3次，在0.1% HgCl₂溶液中浸没处理5 min，最后用无菌水洗涤3次。将最后一次洗涤后的无菌水涂布于平板培养基进行培养，以确定南方红豆杉植株表面消毒是否彻底。用无菌滤纸吸取样本上的多余水分，用无菌手术刀将南方红豆杉的枝条切成小块（0.5 cm×0.5 cm），置于培养基上，在28 ℃下恒温培养，观察平板上的菌落形态和数量。挑取单菌落划线培养，并多次重复，以纯化内生菌株。

1.2.2 南方红豆杉内生细菌的分子鉴定。

采用CTAB法提取细菌基因组DNA，步骤如下：收集适量菌体于1.5 mL离心管中，加入250 μL TE缓冲液重悬菌体，加入20 μL 10%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液混匀后，依次加入10 μL溶菌酶（20 mg/mL）和10 μL RNA酶，然后于37 ℃条件下水浴1 h；依次加入80 μL NaCl溶液（5 mol/L）和50 μL CTAB溶液，缓慢混匀后，置于65 ℃恒温孵育10 min；加入500 μL苯酚/氯仿/异戊醇溶液（25∶24∶1），缓慢混匀后，12 000 r/min离心5 min，小心吸取上清液，重复2～3次，合并上清液；加入500 μL的氯仿/异戊醇（24∶1），缓慢混匀后，12 000 r/min离心5 min，小心吸取上清液，加入等体积异丙醇，缓慢颠倒数次，置于-20 ℃下20 min，12 000 r/min离心5 min，沉淀即为DNA；加入70%乙醇漂洗，12 000 r/min离心2 min，弃去上清，重复2次后，将管中残余乙醇挥发完全，加入TE缓冲液充分溶解，然后保存于-20 ℃条件下备用。

以细菌基因组DNA为模板，扩增16S rDNA序列，引物序列为F8（5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和R1492（5′-CGGCTACCTTGTTACGAC-3′）。PCR扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，25个循环；72 ℃，7 min。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳、胶回收和测序，将序列在NCBI网站进行BLAST分析，选择相似性高的序列，然后利用Mega 7软件构建系统发育树。

1.2.3 南方红豆杉内生细菌的发酵及萃取。

将南方红豆杉内生细菌HDSW接种于LB液体培养基，于28 ℃下摇床培养5 d，离心收集上清液。利用石油醚和乙酸乙酯进行顺序萃取，步骤如下：将发酵上清液转移至分液漏斗中，加入相同体积的石油醚，

充分混匀后静置3 h，收集石油醚相，对水层重复萃取2次，合并石油醚相；向水相中加入等体积乙酸乙酯，充分混匀后静置3 h，收集乙酸乙酯相，对水层重复萃取2次，合并乙酸乙酯相；分别对石油醚相和乙酸乙酯相进行减压浓缩，干燥后，分别获得提取物，经DMSO溶解后，配制浓度为100 mg/mL储液。