辣椒贮藏性病害病原菌的分离鉴定及拮抗菌对其抑制作用研究
作者： 胡秀虹 张廷辉 欧明云 宋敏
摘要 以自然病变的羊角辣椒为原料，采用组织培养法及回接法从中分离筛选优势病原菌。通过形态学观察和ITS全序列分析对优势病原菌进行鉴定，并研究了一株拮抗细菌Bacillus subtilis对优势病原菌的抑制作用。结果表明：导致辣椒在贮藏过程中发生病变的优势病原菌为1株真菌，经鉴定为Botrytis cinerea。研究发现，生防菌Bacillus subtilis对病原菌Botrytis cinerea具有良好的抑制效果，抑菌率可达87.8%。
关键词 辣椒；病原菌；分离鉴定；生防菌；拮抗作用
中图分类号 Q934.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）19-0168-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.19.036
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Isolation and Identification of Pathogenic Bacteria of Storage Venereal Diseases in Capsicum and Study on Their Inhibition by Antagonistic Bacteria
HU Xiu-hong1， ZHANG Ting-hui2， OU Ming-yun1 et al
（1. School of Life and Health Science， Kaili University， Kaili， Guizhou 556011;2. Qiandongnan Food and Drug Inspection and Testing Center， Kaili， Guizhou 556011）
Abstract The dominant pathogenic bacteria were isolated and screened by tissue culture method and tieback method from natural pathological changes of capsicum chinensis. The dominant pathogenic bacteria were identified by morphological observation and ITS sequence analysis. The inhibitory effect of an antagonistic bacterium—Bacillus subtilis on the dominant pathogenic bacteria was studied. The results showed that the dominant pathogenic bacteria that caused the pathological changes of capsicum during storage was a fungus strain， which was identified as Botrytis cinerea. It was found that Bacillus subtilis had good inhibitory effect on Botrytis cinerea with inhibition rate of 87.8%.
Key words Pepper;Pathogenic bacteria;Isolation and identification;Biocontrol bacteria;Antagonism
基金项目 2022年国家级大学生创新创业训练计划项目（20221066-9044）；2022年省级“金课”（一流课程）建设项目（SJJK202221）；2022年度黔东南州基础研究计划项目（黔东南科合基础〔2022〕05号）；凯里学院2023年校级专项课题（2023XJZX0304）。
作者简介 胡秀虹（1986—），女，江西景德镇人，教授，硕士，从事微生物技术与药用植物药效研究。
收稿日期 2024-01-17；修回日期 2024-04-30
辣椒属茄科（Solanaceae Juss.）茄亚族（Solanaceae subfamily）辣椒属（Capsicum L.），多数品种为一年生，部分品种为多年生［1-2］。辣椒上市时间较集中，含水量较高，采摘后仍然进行着旺盛的代谢活动，在贮藏过程中易因温度或物理破坏导致腐烂［3-5］。研究表明，常见果蔬贮藏性病害主要有果腐病（Fusarium sp.）、疫病（Phytophthor acapsici）、炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）、软腐病（Erwinia carotovora）、黑斑病（Alternaria alternata）、灰霉病（Botrytis cinerea）等［6-7］。目前，辣椒采后防腐的方法包括物理防治、化学防治、生物防治以及多种方法联合处理等［4-5，7-9］。物理防治主要是贮藏时的温度控制［4-5］；化学防治主要是使用各种保鲜剂，成本较低［9-10］；生物防治主要包括植物源杀菌剂和微生物源杀菌剂，因其成本低、专一性强、对农产品无污染、不易产生耐药性等特点而备受研究者关注［11］。对植物病原菌具有防治作用的这类微生物，又称为拮抗菌或生防菌［12］。相关研究表明，辣椒病害生防细菌主要有芽孢杆菌属、假单胞菌属以及海洋细菌等，其中以芽孢杆菌属为主［11，13-16］。
贵州地处云贵高原、少数民族众多，糟辣椒是当地的特色名片，而辣椒作为其主要原材料之一，是贵州省重点发展的十二大产业之一。辣椒在采摘、贮藏、运输、加工、销售等环节极易受到机械损伤、微生物侵染等而腐烂变质，这给辣椒产业带来了巨大的损失。笔者以辣椒采后贮藏性病害病原菌为研究切入点，以采后腐烂的辣椒为研究对象，探究其优势致病菌及生防菌对病原菌的抑制作用，以期为后期分离研究生物防腐剂提供菌种资源，也为辣椒乃至其他果蔬采后保鲜提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂与原料。琼脂粉、次氯酸钠，成都市科龙化工试剂厂；PDA培养基、NA培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司；乳酸棉染液，珠海贝索生物技术有限公司；蒸馏水，实验室自制；无菌水，蒸馏水于121 ℃高压灭菌20 min。羊角辣椒，采购于贵州凯里农贸市场。
1.1.2 菌种。拮抗菌：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），分离于贵州中药材多花黄精根茎中。
1.1.3 仪器与设备。FA2004型电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；SW-CJ-2D型双人净化工作台，上海苏净实业有限公司；ZWY-CZ11D型恒温摇床培养振荡器，上海智诚分析仪器有限公司；BGZ-246型电热鼓风干燥箱、SPX-150B-Z型生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LDZX-50kbs型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂。
1.2 方法
1.2.1 病原菌的分离纯化及分类鉴定。采用组织分离法对辣椒病变组织进行病原菌的分离，即切取病组织小块（边长3～4 mm）数块，在质量分数为1%次氯酸钠溶液中浸泡1～2 min，然后放于体积分数为75%乙醇中浸泡20 s，再用无菌水漂洗3次，最后将漂洗好的病组织吸干水分，呈“品”字形置于PDA固体培养基中，放入恒温培养箱中28 ℃培养4～6 d。挑取病组织周围单菌落进行多次纯化培养直至获得纯菌种为止。同时观察菌落形态、颜色及生长速率，并挑取菌丝置于乳酸苯酚液中，加盖片于显微镜下观察病原菌孢子大小与菌丝形态。
按SK8259试剂盒操作提取真菌基因组DNA，采用通用引物ITS1/ITS4 进行 PCR 扩增：ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。扩增体系为 25 μL 反应体系，其中 10×PCR Buffer 5.0 μL，50 mmol/L MgSO4 5.0 μL，10 mmol/L dNTP 2.0 μL，5 U/μL Taq DNA酶0.5 μL，正反向引物（10 μmol/L ITS1和ITS4）各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应程序：预变性 95 ℃，5 min；变性94 ℃，30 s；复性57 ℃，30 s；延伸72 ℃，90 s；30个循环，后延伸 72 ℃，10 min。PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR反应产物纯化后送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果采用GenBank中的BLAST进行比对，通过MEGA 5.0软件构建系统发育树，同时结合形态学观察对致病菌进行分类鉴定。
1.2.2 病原菌回接。将纯化的病原真菌接种于PDA培养基平板上培养5～7 d，将用无菌水洗下的孢子液配制成浓度约为 106 CFU/mL的孢子悬液。采用无菌注射法将病原菌回接到辣椒内，以接种无菌水为对照组。依据科赫法则，待辣椒果实产生病变后，再通过组织分离法对病变组织进行分离纯化，并将分离到的病原菌进行形态鉴定。
1.2.3
拮抗菌对病原菌的抑制作用。首先采用液体培养对峙法考察拮抗菌Bacillus subtilis对病原菌的抑制作用。取上述病原真菌孢子悬液1 mL，放入装有50 mL PDA液体培养基的三角瓶中，同时接种1环拮抗菌为试验组；以接种病原真菌孢子悬液但不接种拮抗菌为对照组，于180 r/min、28 ℃下摇床培养5～7 d。
进一步通过平板对峙法考察拮抗菌Bacillus subtilis对病原菌的抑制作用。具体操作如下：取1环活化的拮抗细菌放入100 mL液体培养基中培养18 h，无菌水稀释制成浓度为 105～106 CFU/mL的菌悬液。取0.5 mL菌悬液采用平板涂布法进行平板涂布，涂布均匀后再在平板正中央接种一块直径为 4 mm的病原真菌菌饼。以不涂布拮抗菌只接种病原真菌的培养皿为对照组，并设置3个平行组。然后将各组培养皿放入28 ℃恒温培养箱中培养，待对照组菌落长至约70 mm，取出各组平板进行菌落直径的测量，并计算抑菌率。
抑菌率=对照组菌落直径-试验组菌落直径对照组菌落直径×100%
2 结果与分析
2.1 病原菌的分离纯化和病原鉴定
通过组织培养法从贮藏性病害的辣椒中分离纯化出1株形态稳定、长势良好的真菌，编号为LJ-2（图1）。研究发现，LJ-2菌株在PDA平板上生长的菌丝表面呈灰白色絮状，背面呈浅褐色，质地质密，匍匐生长，其生长速率为6～10 mm/d。显微镜下，LJ-2菌丝弯曲有隔膜，可见小分生孢子。
经测序，致病性真菌LJ-2的基因序列大小约为538 bp。将各菌株序列在NCBI网站上进行比对，利用MEGA 5.0软件构建系统发育进化树，结果见图2。由图2可知，菌株LJ-2与Botrytis cinerea isolate strain亲缘关系最近，与Trichoderma harzianum isolate strain亲缘关系最远。结合文献报道，可初步判断LJ-2可能为Botrytis cinerea。