3株芽孢杆菌抗菌肽抑菌特性与抑菌谱研究

摘要 ［目的］分离筛选出有抑菌特性的芽孢杆菌，并研究其抑菌谱。［方法］从实验室分离鉴定的71株芽孢杆菌中筛选出对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌性强的新种芽孢杆菌018株、贝莱斯芽孢杆菌F株和解淀粉芽孢杆菌221株，建立比较3株芽孢杆菌的遗传进化树，并应用酸沉淀法提取抗菌肽，比较3种芽孢杆菌抗菌肽提取物对11株动物病原菌的抑菌谱。［结果］3株芽孢杆菌产生的抗菌肽抑菌特性各有不同，其抑菌谱中3种芽孢杆菌抗菌肽提取物对试验菌株中的7株病原菌的抑菌性符合对指示菌的抑菌特性，对维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌略有不同。［结论］芽孢杆菌可为开发应用抗菌肽的生物活性添加剂制剂或生物抗菌性药物提供参考。

关键词 芽孢杆菌；抗菌肽；抑菌特性；抑菌谱

中图分类号 S 816.3  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）20-0088-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.20.021

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on Antibacterial Peptide Characteristics and Antibacterial Spectrum of Three Strains of Bacillus

YU Meng-bo XIE Zhi-heng2，LI Jia-ming2 et al

（1.Department of Veterinary Medicine，College of Coastal Agricultural Sciences，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088;2.Foshan City Nanhai Eastern Along Pharmaceutical Co.，Ltd.，Foshan，Guangdong 528234）

Abstract ［Objective］The aim of this experiment was to isolate and screen Bacillus with antibacterial properties and study its antibacterial spectrum.［Method］From 71 strains of Bacillus spp.isolated and identified in the laboratory，we screened out new species of Bacillus 018，Bacillus velezensis F and Bacillus amyloliquefaciens 22 which are highly inhibitory to Staphylococcus aureus and Escherichia coli，the genetic evolution tree of 3 strains of Bacillus was established and compared，and the antimicrobial peptides were extracted by acid precipitation method.The antibacterial spectra of 3 strains of Bacillus against 11 strains of animal pathogens were compared.［Result］The results showed that the antimicrobial peptides produced by the three strains of Bacillus had different antibacterial properties.The antibacterial peptide extracts of the three strains in the antibacterial spectrum were in line with the antibacterial properties of the seven strains in the test strain against the indicator bacteria，but slightly different against Aeromonas vickerii，Aeromonas hydrophila and Actinobacillus transinfectious pleuropneumoniae.［Conclusion］The results show that Bacillus can provide reference for the development of bioactive additives or bioantibacterial drugs using antimicrobial peptides.

Key words Bacillus antimicrobial;APMs;Antibacterial properties;Antimicrobical spectrum

芽孢杆菌（Bacillus）是一类好氧或兼性厌氧、革兰氏染色阳性、产芽孢的杆状细菌，具有较强的抵抗外界环境压力的能力［1］。抗菌肽（antimicrobial peptides，APMs）又称为抗微生物肽或肽抗生素，是一种具有抗菌、抗病毒和抗真菌活性的小蛋白质。抗菌肽表现出对常见和多重或“超级”的耐药菌株具有抗菌活性，且不易引起耐药性的产生［2］。细菌抗菌肽（bacteriocin）是细菌在代谢过程中通过核糖体合成产生，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和万古霉素耐药性肠球菌（VRE）等耐药菌也能起到良好的抑制作用［3］。芽孢杆菌产生的抗菌肽类物质根据化学结构组成主要分为细菌素、糖肽类、脂肽类和环状肽类。根据其合成途径则主要被分为多酶复合体系统合成的非核糖体抗菌肽以及核糖体合成的抗菌肽两类［4］，非核糖体合成抗菌肽分为表面活性肽（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）和丰原素（fengycin）三大家族［5］。

抗生素在动物饲料“禁抗”、临床应用“减抗”和饲料添加剂及食品生产“无抗”的理念已成共识［6］。在“替抗”方面，芽孢杆菌及其抗菌肽产品研发和应用已成为动物饲料添加剂方面关注的热点，有望成为对抗微生物感染的新替代品及治疗耐药细菌的新方法［7-8］。笔者从实验室分离鉴定的71株芽孢杆菌中筛选出对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌性强的新种芽孢杆菌018株、贝莱斯芽孢杆菌F株和解淀粉芽孢杆菌221株，观察3株芽孢杆菌的抗菌肽提取物的抑菌特性与抑菌谱。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株。从实验室分离鉴定出71株芽孢杆菌中筛选出3株具有抑菌作用的芽孢杆菌，分别命名为新种芽孢杆菌018、贝莱斯芽孢杆菌F和解淀粉芽孢杆菌221。

1.1.2 指示菌。大肠杆菌（K12D31）、金黄色葡萄球菌（ATCC29213）来自中国微生物菌种保藏管理中心。

1.1.3 抑菌谱试验菌株。猪链球菌2型、猪链球菌7型、猪链球菌9型、维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪丹毒杆菌、沙门氏杆菌、大肠杆菌等由佛山科学技术学院预防兽医学重点实验室分离鉴定。

1.1.4 培养基。LB液体培养基、LB琼脂培养基、营养琼脂培养基、牛血清、NAD均购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定。新种芽孢杆菌018、贝莱斯芽孢杆菌F和解淀粉芽孢杆菌221菌株16S rDNA序列，广州艾基生物技术有限公司测定。

1.2.2 菌株培养。

指示菌培养：将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别采用普通琼脂平板划线培养24 h，挑取典型菌落，接种于LB培养基，37 ℃，振摇（180 r/min）培养16～24 h，细菌浓度为OD 1.0（600nm），取出，置于4 ℃，备用。

抑菌谱试验菌株培养：猪链球菌2型、猪链球菌7型、猪链球菌9型、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌接种于0.2% NAD、0.5%血清液体LB培养基；维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、多杀性巴氏杆菌、猪丹毒杆菌、沙门氏杆菌、大肠杆菌接种于LB液体培养基，37 ℃，18～24 h取出，置于4 ℃，备用。

芽孢杆菌培养：分别将新种芽孢杆菌018、贝莱斯芽孢杆菌F和解淀粉芽孢杆菌221株菌株平板划线后于37 ℃培养箱培养24 h，选取每种菌株的典型菌株于LB液体培养基中，37 ℃ 180 r/min摇床中振荡培养24 h，作为种子液。

1.2.3 发酵液与抗菌肽提取物的制备。

将各株芽孢杆菌菌株的种子液以1%接种量接到LB液体培养基中，装瓶量100 mL/150 mL，37 ℃，180 r/min振荡培养48 h，即得发酵液。

抗菌肽提取物制备：分别将新种芽孢杆菌018、贝莱斯芽孢杆菌F和解淀粉芽孢杆菌221株菌株发酵液置于离心机上，于4 ℃ 1×104 r/min条件下离心10 min，弃沉淀即得发酵上清液。将获得的发酵上清液以1 mol/L HCL，调节pH为2.0，使蛋白絮凝沉淀，1×104 r/min离心10 min；静置2 h，再将蛋白絮凝沉淀按原体积的1/10溶于PBS缓冲液中，保存备用。

1.2.4 分离菌抗菌肽提取物抑菌试验。

采用琼脂扩散法测定分离菌的抑菌性。取高压灭菌后冷却至50～56 ℃，LB琼脂分别加指示菌液（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）、维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、多杀性巴氏杆菌、猪丹毒杆菌、沙门氏杆菌、大肠杆菌菌株菌液每平皿约20 μL于平板中，同时注入15～20 mL LB琼脂摇匀，再取猪链球菌2型、猪链球菌7型、猪链球菌9型、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌菌株菌液，分别加每平皿约20 μL于平板中，并按0.2%NAD、0.5%血清加入每一平皿，注入15～20 mL LB琼脂摇匀，风干表面凝集水，备用。取出待测分离菌液，使用打孔器（直径6 mm）取被测菌液（约60 μL）加入孔内，以培养基作对照，每株菌作3皿次重复，于37 ℃ 18～24 h取出，使用游标卡尺计量抑菌圈直径（mm），记录结果。

2 结果与分析

2.1 3株芽孢杆菌的遗传进化树

建立的新种芽孢杆菌018、贝莱斯芽孢杆菌F和解淀粉芽孢杆菌221菌株的遗传进化树见图1。从图1可见，3株芽孢杆菌遗传进化属于不同分支，是不同种芽孢杆菌的代表株。

2.2 3种抗菌肽提取物的抑菌特性

新种芽孢杆菌018、贝莱斯芽孢杆菌F和解淀粉芽孢杆菌221菌株抗菌肽提取物抑菌特性如图2所示，新种芽孢杆菌018抗菌肽提取物对金黄色葡萄球菌抑菌性强，抑菌圈直径为14 mm，对大肠杆菌的抑菌圈直径为8 mm；解淀粉芽孢杆菌221的抗菌肽提取物对大肠杆菌抑菌性强，抑菌圈直径为19 mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为8 mm；而贝莱斯芽孢杆菌F的抗菌肽提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌性均较强，抑菌圈直径分别为16和21 mm。由此可见，新种芽孢杆菌018、贝莱斯芽孢杆菌F和解淀粉芽孢杆菌221菌株产生的抗菌肽抑菌特性不同，新种芽孢杆菌018抗菌肽提取物对革兰氏阳性菌抑菌性强；解淀粉芽孢杆菌221的抗菌肽提取物对革兰氏阴性菌抑菌性强；而贝莱斯芽孢杆菌F的抗菌肽提取物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌性均较强。

2.3 3种抗菌肽提取物的抑菌谱

对猪链球菌2型、猪链球菌7型、猪链球菌9型、维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪丹毒杆菌、沙门氏杆菌、大肠杆菌进行抑菌谱试验，结果如图3和表1所示。3种芽孢杆菌抗菌肽提取物对试验菌株中的8株菌的抑菌性符合对指示菌的抑菌特性，但对维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌（水产养殖病原菌）和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的抑菌性略有不同。